GATA4基因启动子在心肌梗死病人中遗传和功能变异研究

发布时间：2020-09-01 07:53

　　 研究背景:急性心肌梗死(AMI)是冠状动脉性疾病(CAD)的一个主要类型,主要是由动脉粥样硬化斑块破裂后堵塞冠脉血管导致冠状动脉血流减少或中断引起。现在的研究结果表明动脉粥样硬化是由各种原因导致的血管内皮损伤引起,其病理机制主要涉及机体代谢、细胞炎症、自噬和衰老等多个过程。我们都知道,冠心病的发生受基因和环境等多种因素共同影响。GATA4是一种在心脏中大量表达的锌指结构转录因子,在心血管发育、自噬、衰老与机体代谢等方面扮演着非常重要的角色。在基因表达过程中,目的基因表达水平受启动子的调控。由此,我们可推测GATA4基因启动子序列变异在急性心肌梗死的发生、发展过程中发挥着重要作用。目的:研究急性心肌梗死病人和健康对照人群中GATA4基因启动子序列变异情况,针对变异序列构建pGL3报告基因表达载体,通过检测双荧光素酶活性,对GATA4基因启动子转录水平的改变进行分析,通过凝胶迁移实验发现蛋白与DNA结合情况及对转录因子结合位点的影响,从而证实遗传变异对基因表达水平的影响及GATA4基因突变与急性心肌梗死病理机制的关系。方法:1、本研究包括两组研究对象,分别为急性心肌梗死病人组和健康对照组,其中急性心肌梗死病人组395例,健康对照人群397例,记录并统计两组人群临床资料信息,分离外周血单个核细胞并对基因组DNA进行提取。2、参照NCBI数据库上人GATA4基因启动子序列,设计、合成引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增的办法扩增GATA4基因启动子目的片段,然后直接进行基因测序,根据测序结果将GATA4基因启动子序列变异位点统计并分析。3、将野生型目的基因片段和经基因测序发现携带GATA4基因启动子序列变异位点的目的片段分别构建到PMD19-T载体,提取质粒,扩增、酶切后连接PGL3-basic报告基因载体,采用内参质粒PRL-TK和PGL3-basic报告基因载体脂质体共转染的方法,体外转染H9c2细胞及HEK293细胞,转染后检测两种细胞中双荧光素酶活性,记录并统计结果,初步探讨GATA4基因启动子序列变异对基因转录活性的影响。4、将含有GATA4基因启动子变异位点的DNA序列设计成生物素标记的探针,分别与HEK293细胞和H9c2细胞的核提取物进行结合反应,然后进行凝胶迁移实验(EMSA),转膜后用化学发光法检测生物素标记的探针与核蛋白的结合情况,进一步探讨GATA4基因启动子序列变异对转录因子结合位点的影响。结果:1、通过基因测序,共发现14个DNA序列变异位点(DSVs),包括1个插入突变 g.31979-31980InsG 和 2 个 SNPs 位点:g.31360TC(rs372004083)和g.31437CA(rs769262495),在急性心肌梗死病人和正常对照组中均有出现,差异无统计学意义(P0.05)。在急性心肌梗死病人组中发现的3个DSVs,分别为g.31806CT、g.31900GC和g.32241CT,而在健康对照组中并未发现。其中有 8 个 DSVs,分别为 g.31403GT、g.31492TA、g.31566GC、g.31567AG、g.31715CA、g.31730AG、g.32171AG 和 g.32190CT 仅存在与健康对照组中,在急性心肌梗死病人组中尚未发现。2、成功构建含有GATA4基因启动子野生型和序列变异位点的PGL3-basic 报告基因载体,分别为 PGL3-WT、PGL3-31403T、PGL3-31492A、PGL3-31566C、PGL3-31715A、PGL3-31730G、PGL3-31806T、PGL3-31900C和 PGL3-32241T。3、在体外瞬时转染的H9c2细胞和HEK293细胞中,仅在急性心肌梗死病人组中发现的DSVs能改变GATA4基因启动子转录活性:g.31806CT、g.31900GC和g.32241CT均能升高GATA4基因启动子转录活性(P0.01)。发现的其余DSVs均未能改变GATA4基因启动子的转录活性(P0.05)。4、凝胶迁移实验后经化学发光法检测细胞核提取物与DNA结合情况,g.31806CT和g.31900GC变异位点未见明显特异性结合条带,g.32241CT基因变异位点有特异性结合条带,并且其WT与DSV结合情况有明显差异。结论:在AMI病人中发现的GATA4基因启动子序列变异位点可能会影响GATA4基因的转录活性及转录因子结合位点,进而影响基因表达水平,在AMI的发生发展过程中发挥着重要作用,为AMI的病理机制、预防、诊断与治疗提供了新的思路。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R542.22
【部分图文】：

图１：上为ＧＡＴＡ４基因启动子片段１邋（５１０ｂｐ），泳道１－１０为其扩增产物条带，逡逑泳道１１为Ｄ２０００邋Ｐｌｕｓ邋ｍａｒｋｅｒ条带；下为ＧＡＴＡ４基因启动子片段２邋（５６９ｂｐ），逡逑泳道１－１０为其扩增产物条带，泳道１１为Ｄ２０００邋Ｐｌｕｓ邋ｍａｒｋｅｒ条带；均符合目的逡逑片段大小。逡逑ｇ．３１５６６Ｇ＞Ｃ逦ｇ．３１７３０Ａ＞Ｇ逡逑ｇ．３１４９２Ｔ＞Ａ逦ｇ．３１８０６Ｃ＞Ｔ逡逑ｇ．３１４３７Ｃ＞Ａ逦ｇ．３１９００Ｇ＞Ｃ逦ｇ．３２１９０Ｃ＞Ｔ逡逑ｇ．３１４０３Ｇ＞Ｔ逦ｇ．３１９７９＿８０ｌｎｓＧ逦ｇ．３２２４１Ｃ＞Ｔ逡逑＇邋１逡逑Ｉ逦ｉ邋＼ｔ邋ｉ邋ｉ邋＼邋Ｉ邋Ｉ邋１逦Ｉ逦？邋ｒ逦逡逑－１０００逦“逦－８００逦－６００逦１逦－４００逦－２００逦＋１邋Ｅｘ0ｎ１逡逑ｇ．３１３６０Ｔ＞Ｃ逦ｇ．３１５６７Ａ＞Ｇ逦ｇ．３１７１５Ｃ＞Ａ逦ｇ．３２１７１Ａ＞Ｇ逡逑

１逦２３４５６７８９逦１０邋１１逡逑图１：上为ＧＡＴＡ４基因启动子片段１邋（５１０ｂｐ），泳道１－１０为其扩增产物条带，逡逑泳道１１为Ｄ２０００邋Ｐｌｕｓ邋ｍａｒｋｅｒ条带；下为ＧＡＴＡ４基因启动子片段２邋（５６９ｂｐ），逡逑泳道１－１０为其扩增产物条带，泳道１１为Ｄ２０００邋Ｐｌｕｓ邋ｍａｒｋｅｒ条带；均符合目的逡逑片段大小。逡逑

图３：此为ＡＭＩ病人组中发现的ＤＳＶｓ测序色谱图，这３个ＤＳＶｓ：邋ｇ．３１８０６Ｃ＞Ｔ，逡逑ｇ．３１９００Ｇ＞Ｃ和ｇ．３２２４１Ｃ＞Ｔ，上为野生型ＤＮＡ序列，下为杂合型ＤＮＡ序列，逡逑箭头标示为ＤＮＡ序列变异位点。逡逑

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本文编号：2809465