乳腺癌组织中FANCF相关基因的表达及其与顺铂耐药的作用机制研究

发布时间：2020-09-01 12:50

　　 [目的]研究非化疗组和化疗组不同亚型乳腺癌组织中FANCF相关基因mRNA的表达情况,寻找与乳腺癌密切相关的FA通路基因;在此基础上进一步研究顺铂耐药的癌组织中FANCF的表达情况;通过建立三阴型乳腺癌细胞MDA-MB-231顺铂耐药细胞模型,验证FANCF耐药前后的差异表达,并通过RNAi干扰技术敲低FANCF的表达,探讨FANCF在乳腺癌顺铂耐药中的作用及其机制。[方法]收集手术切除的女性乳腺癌患者乳腺癌组织和正常乳腺组织标本共93例,其中非化疗组的三阴型乳腺癌、Luminal型乳腺癌、HER2阳性型乳腺癌各20例,化疗组相对应的三型乳腺癌分别为11、13和9例。采用实时荧光定量RT-PCR法检测乳腺癌组织和正常乳腺组织中的FANCF相关基因FANCA、FANCD2、FANCF、FANCI、BRCA1和BRCA2 mRNA的表达水平。收集顺铂敏感和顺铂耐药的乳腺癌复发转移灶组织石蜡切片共27例,其中顺铂敏感14例、顺铂耐药13例,采用免疫组化方法检测FANCF在其中的表达。以体外药物浓度递增法建立三阴型乳腺癌细胞MDA-MB-231顺铂耐药细胞模型。CCK8法检测细胞的顺铂抑制活性，实时荧光定量RT-PCR法检测诱导顺铂耐药前后FANCF的mRNA表达,Western blotting法验证差异蛋白的表达。通过RNAi干扰技术敲低MDA-MB-231敏感细胞和顺铂耐药细胞中FANCF的表达,在mRNA和蛋白水平进行敲低效果验证。以CCK8法检测顺铂对两种细胞的IC50,流式细胞仪分析细胞凋亡的情况。[结果】1、FANCA、FANCF、FANCD2、FANCI、BRCA1 和 BRCA2 在 93 例非化疗组和化疗组患者组织样本的mRNA表达:非化疗组三阴型、Luminal型、HER2型乳腺癌组织中FANCF基因mRNA相对表达量均低于相应正常乳腺组织(P0.01)，HER2 型乳腺癌组织中 BRCAI、BRCA2、FANCI 和 FANCD2 基因mRNA相对表达量高于对应的正常乳腺组织且均高于三阴型和Luminal型乳腺癌组织中的mRNA表达量,三阴型乳腺癌组织中FANCD2和FANCI基因的mRNA相对表达量高于相应的正常乳腺组织,Luminal型乳腺癌组织中FANCA基因mRNA表达量高于HER2型和三阴型(P0.05);化疗组患者的组织样本中三阴型乳腺癌组织中除FANCF外其余5个基因表达量均非常低,Luminal型和HER2型乳腺癌组织中BRCA1、FANCI的表达均显著高于正常乳腺组织,Luminal型乳腺癌患者BRCA1、BRCA2、FANCA、FANCI基因mRNA表达量均高于三阴型和HER2型(P均0.05);化疗组三种亚型乳腺癌组织中FANCF的表达水平高于非化疗组(P0.05)，且TNBC组差异最显著,三阴型和HER2型乳腺癌组织的BRCA1、BRCA2、FANCD2、FANCI基因mRNA表达量显著低于对应非化疗组患者的乳腺癌组织的表达量(P0.05)；基因相关性分析结果显示FANCF的表达与其余5个基因的表达水平呈现显著负相关,FANCA、FANCD2、FANCI、BRCA2、BRCA1 5个基因之间的表达水平呈显著正相关。2、免疫组化检测发现FANCF在顺铂耐药的乳腺癌复发转移灶中的表达显著高于顺铂敏感的乳腺癌复发转移组织(P0.05)。3、体外顺铂浓度递增法诱导MDA-MB-231细胞顺铂耐药3个月后的耐药指数为13.5,GO/G1期细胞增多、S期和G2/M期细胞减少。在顺铂耐药的乳腺癌细胞中FANCF的mRNA和蛋白表达水平显著升高(.P0.05)。4、使用 RNAi 干扰技术敲低 FANCF 后,MDA-MB-231 和 MDA-MB-231/Pt 细胞凋亡增加、细胞对顺铂的药物敏感性显著升高,且以MDA-MB-231/Pt细胞明显。[结论]1、FANCF基因在非化疗组乳腺癌组织中相对表达量均低于相应正常乳腺组织,而在化疗组乳腺癌组织中FANCF基因mRNA的表达上调,提示这与化疗药物的使用有一定关系;FANCF mRNA在非化疗组和化疗组乳腺癌组织中的表达存在差异,尤其在TNBC中的表达差异最为显著;三种不同亚型乳腺癌组织中FANCF相关基因的表达差异性较大,新辅助化疗可在一定程度上影响BRCA1、BRCA2.FANCD2.FANCI 的表达。2、FANCF在顺铂耐药的乳腺癌复发转移组织中的表达显著增加,提示FANCF可能与乳腺癌顺铂耐药有关。3、在三阴型乳腺癌细胞MDA-MB-231顺铂耐药细胞模型中,顺铂耐药细胞MDA-MB-231/Pt较敏感细胞MDA-MB-231中FANCF的mRNA和蛋白表达水平均显著升高,推测三阴型乳腺癌细胞MDA-MB-231顺铂耐药性的产生可能与FANCF基因的表达上调有关。4、体外合成 FANCF-siRNA,敲低 MDA-MB-231 和 MDA-MB-231/Pt 细胞的FANCF后,细胞对顺铂的敏感性均增加,细胞凋亡率亦显著增加,且以MDA-MB-231/Pt细胞更为明显,提示FANCF可能通过抗凋亡的作用参与三阴型乳腺癌细胞MDA-MB-231顺铂耐药的发生,FANCF有望成为乳腺癌顺铂耐药的潜在治疗靶点。
【学位单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.9
【部分图文】：

相对表达水平进行分析。逡逑２．１非化疗组的乳腺癌组织和正常乳腺组织中ＦＡＮＣＦ相关基因的ｍＲＮＡ表达逡逑如图１所示，在非化疗组患者的组织样本中，三阴型、Ｌｕｍｉｎａｌ型、ＨＥＲ２型逡逑２６逡逑

图２化疗组癌组织和正常组织ＦＡＮＣＦ相关基因的ｍＲＮＡ表达逡逑

槿橄侔┳橹嶝疲粒危茫葡喙鼗饷颍恚遥危帘泶锉冉希]3?如图３所示，在化疗组患者的乳腺癌组织样本中，三种亚型乳腺癌组织中逡逑ＦＡＮＣＦ的表达水平高于非化疗组（Ｐ＜０．０５），其中ＴＮＢＣ组差异最为显著；化疗逡逑组的三阴型乳腺癌组织中除ＦＡＮＣＦ外

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本文编号：2809757