玉米籽粒突变基因Mn219和Dek39的图位克隆与基因功能分析

发布时间：2020-09-27 12:29

　　玉米是目前世界上分布最广的作物之一,其对环境具有高度的适应性,并且其产量也高,所以其在保障世界粮食安全中发挥着举足轻重的作用。玉米产量直接体现于玉米的籽粒,而胚和胚乳是玉米籽粒的重要组成部分,所以研究胚和胚乳发育的相关基因,有助于我们对玉米籽粒发育机理的研究,也可以为提高玉米产量提供理论基础。在本课题中,我们通过EMS诱变的方式获得了两种籽粒突变体mn219和dek39,利用图位克隆技术分离出相应的基因,而后对这两个基因进行了比较详细的功能分析。mn219突变体与野生型相比,表型表现为籽粒变小,变薄,胚乳中粉质胚乳比例降低,硬质胚乳变多,发芽率偏低,苗期存在部分致死现象。植株生长缓慢,花期偏迟,并且花期不集中,该突变体是一种单基因隐性突变体。Mn219定位在玉米二号染色体上的短臂端48.19 Mb到48.91 Mb的区间范围内,通过对候选基因的分析验证,我们发现在GRMZM2G018223这个基因上存在着G到A的突变,导致该基因翻译提前终止。该基因编码Elongator复合体的一个亚基ELP1,影响基因的转录延伸。Mn219的突变降低了 H3K14位点的乙酰化水平,从而影响了下游基因的表达。通过转录组测序发现在mn219中,两个与Bak1功能相关的基因(GRMZM2G176922和AC21 7401.3_F_003)的表达水平发生了下调,Bak1与油菜素内酯信号传导途径相关。通过油菜素内酯处理实验,我们发现mn219对油菜素内酯的敏感程度降低。我们的结果显示Mn219在籽粒发育的过程中起着重要的作用,影响着籽粒发育。dek39突变体与野生型相比,表型表现为籽粒变薄,存在皱缩现象,胚和胚乳发育均不正常,发芽率很低,苗期致死;植株不能存活,无法得到纯合突变体果穗。该突变体是一种单基因隐性突变体。Dek39定位在玉米九号染色体上的长臂端111.3 Mb到112.5 Mb的区间范围内,通过对候选基因的分析验证,我们发现在GRMZM2G345128这个基因上存在着G到A的突变,导致了该基因翻译提前终止。DEK39是一个P-L-S亚家族的PPR蛋白,并且含有E结构域,在线粒体和叶绿体中均有表达。在线粒体中,我们发现nadd3-247和nad3-275两个位点的编辑效率下降,nad3-275位点甚至丧失了编辑功能。但是在叶绿体中,没有发现有位点在编辑效率上发生变化。nad3-247和nad3-275两个位点的编辑效率的降低导致了线粒体复合体I的活性的下降。我们的研究结果显示Dek39参与RNA编辑,在籽粒发育过程中扮演着十分重要的角色。
【学位单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S513
【部分图文】：

玉米籽粒,结构示意图,胚乳

１．１玉米籽粒发育研究进展逡逑１．１．１玉米籽粒的结构逡逑玉米籽粒主要由胚乳和胚构成，外围由一层果皮包被着（图１－１Ａ）。玉米在双受精之后，一逡逑个精细胞与卵细胞结合形成胚，胚在整个成熟籽粒中所占的比重约为１５％，完整的胚包括叶原基，逡逑茎分生组织，根分生组织。另一个精细胞与两个极核结合形成胚乳，属于三倍体的结构。胚乳在逡逑成熟的籽粒中占到了邋８５％左右的比例，胚乳从结构上可分成四个部分［１］（图１－１Ｂ）。这四个部分逡逑分别为：ａ．糊粉层（ａｌｅｕｒ0ｎｅ，ＡＬ），糊粉层位于胚乳的最外层，由一层细胞组成，这层细胞富含逡逑蛋白质和油分等，在种子发芽过程中起着重要的作用［２］；饫淀粉细胞层（ｓｔａｒｃｈｅｎｄｏｓｐｅｒａｉ，邋ＳＥ），逡逑是胚乳的主要组成部分，含有淀粉和蛋白质等物质；ｃ．胚乳基质转移层（ｂａｓａｌ邋ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ邋ｔｒａｎｓｆｅｒ逡逑ｌａｙｅｒ，邋ＢＥＴＬ），其位于底部胚乳与底部果皮及穗轴相连接的部位，该层细胞的长度比其它部位细逡逑胞长

基序,家族

有一些ＰＰＲ的基序含有３６个氧基酸，称为Ｌ基序。还有一些含有较少氨基酸数目的ＰＰＲ逡逑基序，较为常见的有３１个氨基酸，称为Ｓ基序。ＰＰＲ蛋白家族主要有Ｐ亚家族和ＰＬＳ亚家族［７６］，逡逑Ｐ亚家族只包含Ｐ基序（图１－３Ａ），而ＰＬＳ亚家族除了含有Ｐ基序外，还含有Ｌ基序和Ｓ基序。逡逑这些基序不仅在氨基酸组成数目上存在差异，而且在序列构成的保守氨基酸上也有所不同（图逡逑１－３Ｂ）。比如和雄性不育相关的ＲＦＯ蛋白就是典型的Ｐ亚家族ＰＰＲ蛋白［８°］，在拟南芥中发现的逡逑与电子呼吸传递链相关的ＣＲＲ２蛋白就属于ＰＬＳ亚家族ＰＰＲ蛋白［８１］。逡逑大多数的Ｐ亚家族成员都含有１个或多个Ｐ基序，在蛋白的氨基端有蛋白的定位信号肽。但逡逑是也有少数的Ｐ亚家族的竣基端含有一个ＳＭＲ结构域，可能具有切割ＲＮＡ或者ＤＮＡ的核酸外逡逑切酶活性，但是还没有充足的证据证明这一点。ＰＬＳ亚家族的ＰＰＲ蛋白通常还有额外的带有特殊逡逑功能的Ｃ端结构域：Ｅ结构域和ＤＹＷ结构域［７７］，这些结构域参与到细胞器的ＲＮＡ－ｅｄｉｔｉｎｇ中，逡逑会在一些特定的位点通过对ＲＮＡ的脱氨基作用完成胞嘧啶到尿嘧啶的转变［８２］。逡逑１．４．２逦ＰＰＲ蛋白的分子功能逡逑对于ＰＰＲ蛋白在分子层面的研宄最近取得了比较快的进展，大量遗传学实验表明ＰＰＲ蛋白逡逑参与细胞器ＲＮＡ表达的各个环节：ＲＮＡ的稳定

果穗,表型,突变体,籽粒

２．３．２．１突变体}0奶的籽粒表型逡逑观察纯合突变体的果穗，以野生型（Ｂ７３）的果穗为对照，可以发现突变体的果逡逑穗偏小，籽粒排布较松散（图２－１Ａ）。与野生型的籽粒比较，突变体的籽粒明显变小（图逡逑２－１Ｂ）；突变体的粉质胚乳的比例降低，角质胚乳的比例增加（图２－ｌＣ，Ｄ）。在Ｆ２Ｒ杂合果逡逑穗中，可以清晰地看到突变籽粒与正常籽粒的分离（图２－２），经过统计，突变籽粒与正常逡逑籽粒的比例符合１：邋３的比例，所以推断该突变体是单突变体，突变基因为隐性基因。逡逑我们在观察图２－１Ｄ的时候，发现的角质胚乳与淀粉胚乳的比例大于野生型中的逡逑比例，所以我们推测突变体中的籽粒组分含量与野生型中的籽粒组分含量有很大的差异。我逡逑们利用了远红外分析仪来检测突变体与野生型中的籽粒组分含量。该远红外分析仪有单粒检逡逑测和单杯（约２００粒籽粒）测量的方式，我们采取了单杯测量的方式，每个样品各测了三个逡逑重复，主要检测了蛋白含量、油分含量和淀粉含量这三组组分。通过检测分析，我们发现突逡逑变体和野生型在这三组组分的含量上并无明显差异。具体结果见表２－１和图２－３。逡逑为了了解籽粒发育过程中与野生型的区别以及变化

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