贝莱斯芽孢杆菌CMT-6的surfactin合成基因表征及其响应溶氧的调控通路研究

发布时间：2020-09-30 21:17

　　贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)为淀粉液化芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌亲缘相近的新种,三者均是生产surfactin的主要菌种。surfactin是构成抗菌脂肽的核心成分,具有极强的生物表面活性,表现出优异的抗菌作用及良好的起泡性和乳化性能,在食品、医药、化妆品和养殖等领域中发挥着重要的作用。然而目前大多数芽孢杆菌的surfactin产率较低,其中的原因也尚不知晓,是制约surfactin大规模生产和商业化应用的主要原因。此外,目前微生物发酵生产surfactin的工艺中,常通过转速提升增加溶氧量以实现surfactin的过量积累。但是具有生物表面活性剂特性的surfactin在转速过高的环境中会形成过量泡沫而出现“跑液”现象,进而造成surfactin的大量损耗。所以溶氧环境是决定surfactin产量的关键因素。因此,本论文以高产surfactin的贝莱斯芽孢杆菌CMT-6为研究菌株,利用全基因组从头测序技术分析CMT-6的基因组信息,挖掘合成surfactin的关联基因,同时与另外三株产量较低的芽孢杆菌进行比较基因组学研究,揭示surfactin合成能力差异的原因,解析高产菌株的surfactin合成基因的特征,进一步利用转录组学技术研究不同溶氧条件下CMT-6的转录组信息,探明溶氧调控surfactin合成的关键基因和代谢通路,为天然高产菌株的高效筛选和工程菌株的构建,以及为低氧高产surfactin生产工艺的研发奠定理论基础和提供新的思路。主要研究内容与结果如下:1、对CMT-6进行全基因组从头测序,分析CMT-6基因组组分及功能,特异性筛查抗菌脂肽相关基因,并采用TOF-MS技术检测CMT-6发酵液中脂肽成分。结果表明,CMT-6基因组为3,928,489 bp,GC含量为46.55%。COG注释得到的基因主要涉及碳水化合物、氨基酸转运和代谢和次级代谢产物的生物合成、转运和分解代谢等。KEGG注释得到的基因主要参与碳水化合物代谢和信号传导路径中。注释到GO中的基因主要行使催化活性、代谢过程和细胞分化过程。以上这些基因能使菌体高效响应外界环境变化,为CMT-6的生长提供营养物质,编码合成更多的脂肽前体物质。CMT-6含有完整的surfactin合成酶基因,srfAA-AD;合成surfactin的相关基因比iturin和fengycin的多。CMT-6发酵产物含有的surfactin组分(m/z:994.6,1008.6,1009.6,1010.6,1022.6,1036.6)比iturin(m/z:1044.6,1058.6,1059.6)和fengycin(m/z:1434.6)的丰富。脂肽合成基因的数量与脂肽组分的丰富度呈正相关,是CMT-6过量积累surfactin的重要原因。2、选取不同种属的芽孢杆菌B.subtilis 168、B.amyloliquefaciens DSM7~T和B.velezensis FZB 42,与CMT-6的基因组进行比较分析,从基因组水平揭示不同种属芽孢杆菌产surfactin能力差异的来源。结果显示,CMT-6与FZB 42有非常保守的序列结构,亲缘关系最近,其次为DSM7~T,与168菌株的亲缘关系最远。不同菌株间的共线性关系与亲缘关系吻合,遗传背景会引起菌株合成surfactin能力的差异。CMT-6与FZB 42和DSM7~T均共有5个surfactin合成基因;与168菌株仅有3个共有基因,相似度较低。菌株间共有基因的数量及其相似度影响surfactin的合成。CMT-6与FZB42仅有合成酶基因srfAC发生非同义突变,与DSM7~T的合成酶基因srfAA、srfAB、srfAC及相关基因spoVT、codY存在非同义突变,与168菌株除上述基因的非同义突变外,其srfAA还检测到提前终止密码子。合成酶基因发生的非同义突变会改变对氨基酸的特异性选择,造成surfactin组分的差异。而合成酶中提前终止密码子的出现,会直接导致菌体丧失合成surfactin的能力。3、设置转速分别为50 rpm(低溶氧)、100 rpm(中溶氧)、200 rpm(高溶氧)的溶氧组,收集菌体提取RNA进行转录组测序分析,研究不同溶氧处理条件下的转录组表达差异,挖掘溶氧调控surfactin的合成的关键基因和通路。结果发现,转录组差异最大的是低溶氧组和中溶氧组,其差异基因功能主要富集到细菌型依赖鞭毛的运动和鞭毛基底两个GO Item中和metabolic pathways的代谢通路上。中溶氧和高溶氧组的差异基因富集到7个GO Item中(集中在氧化还原过程),KEGG富集到不同环境中微生物代谢、碳代谢和双组份系统三个通路上。从转录组表达情况分析发现高溶氧组中碳代谢、脂肪酸合成、双组份系统、蛋白释放等路径中基因的表达可以编码合成更多的surfactin前体物质,增强自身细胞对surfactin的耐受性,促进surfactin的外排,有利于surfactin产量的提高。surfactin合成酶基因srfAA、srfAC、srfAD与产量呈负相关,共同受sRNA rne5的调控;与产量呈正相关的基因有srfAB、spoVT、AbrB、comP和rapC。
【学位单位】：广东海洋大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q933
【部分图文】：

一级结构

究进展以产生一类结构相似，具有广谱抗菌等活性的表面活性和多种生物活性，在多种脂肽中脱。结构和性质者 Arima 等人在枯草芽孢杆菌的发酵液中分离晰了 surfactin 的一级结构，阐明了结构中氨基。Surfactin 家族的结构相似，是由一条碳原子数手性（LLDLLDL）的 7 个氨基酸残基的小肽通量为 1,000 Da 左右，一般不超过 1,500 Da[76]。的碳原子个数及其不同的支链形式赋予了 surfa系物的种类[77]。其中，引起种类差异的氨基酸为 Val 或 Ile，而 Val、Ile 或 Leu 可存在于第 7 位

三维结构

图 1-2 surfactin 的三维结构[74]Fig. 1-2 Three-dimensional structure of surfactin 20 μM 甚至更低浓度时，便可将水的表面张力从 72的去污剂小了约量个数量级[81, 82]。作为强有力的生物使 surfactin 分子中肽环伸入细胞的水相中，而非极性层中，细胞膜便会形成孔洞致使细胞质外泄，破坏细生物活性及其应用结构，赋予 surfactin 众多优异的生物活性。Surfactin是于钙离子的结合会发挥更强的破坏作用，因而使其tin 主要作用对象为细菌，但是与 iturinA 协同作用时的好[85]；surfactin 插入磷脂双分子层造成细胞膜穿孔有代替传统抗生素成为新一代抗生素的潜力。目前，

过程图,生物合成,过程,肽链

芽孢杆菌 CMT-6 的 surfactin 合成基因表征及其响应溶氧的调控通路研进而在 ATP 作用下腺苷化成为氨酰-AMP（氨酰腺苷酸）；氨酰-AM下游硫醇化结构域，与该结构域上的辅基 4’- 磷酸泛酰巯基-sphopantetheine，4’-pp）形成硫酯键，以氨酰载体复合体传送至缩合结构域催化第一个氨基酸脱离其载体，以肽键的形式结合第二个模块肽链向下一个模块移动，肽链以此形式得到不断的延伸；待肽链中的完以后，硫酯酶结构域完成分子的环化并释放。surfactin 合成酶亚基各行其职，完成氨基酸的活化、肽链的延伸，并最终环化释放出 surf

【参考文献】