小麦脱水素WZY1-2基因的遗传转化及在小麦不同生育期的时空表达

发布时间：2020-10-01 06:28

　　干旱是限制农业生产的一个重要的环境因素,全球干旱、半干旱地区约占土地总面积的36%,占耕地面积的43%。我国干旱、半干旱地区面积约占全国土地面积的二分之一,主要分布于西北地区。小麦是主要粮食作物之一,干旱影响植物的生长发育,造成10%-20%的作物减产。因此,研究小麦的抗旱机理对粮食增产具有重要意义。脱水素是胚胎发育晚期积累的蛋白之一,属于热稳定的水溶性蛋白,它受寒冷、高温、干旱以及盐胁迫等逆境诱导,对保护生物代谢可能起到分子伴侣的作用,对细胞膜结构的稳定性起保护作用,从而减轻干旱对植物造成的伤害。wzy1-2基因是本实验室从水分胁迫的郑引1号小麦中克隆获得的脱水素成员,为了进一步解析该基因的抗旱功能,我们采用RNA干扰技术,在目的基因转录后可以剔除该基因的表达,得到缺失突变体,为基因功能研究提供材料。本文根据同源分析,在脱水素wzy1-2基因序列中选择了298bp的cDNA序列作为干扰片段,将克隆的干扰片段插入高效植物干扰表达载体pTCK303的多克隆位点中,成功构建含反向重复序列的RNA干扰表达载体。以郑引1号小麦的幼胚为外植体,采用基因枪法轰击2512个幼胚的愈伤组织,获得再生植株26株,再生率为1.03%。利用表达载体上Hpt基因的特异引物,对所获得26株T_0代再生植株进行PCR分析,检测到6株Hpt基因阳性植株,Hpt基因阳性转化率为0.24%。通过对目的基因实时定量分析,目的基因表达量下降显著。在制备转基因材料的同时,我们研究了脱水素WZY1-2在小麦整个生长过程中4个不同生长时期(苗期、分蘖期、拔节期和开花期)的干旱处理的表达规律,为进一步了解该基因在小麦整个生长过程中表达模式。选取了两个耐旱型不同的小麦品种,陕合6号和郑引1号,在小麦生长的4个不同生长时期,进行干旱胁迫处理,观察该基因的表达规律。结果表明,干旱程度越严重,小麦WZY1-2蛋白的表达量越高。苗期小麦WZY1-2蛋白的表达量均比其它3个生长时期高。Western blot结果表明,陕合6号和郑引1号的非特异性条带单一。从分子水平得出小麦WZY1-2是干旱诱导型基因。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S512.1
【部分图文】：

克隆载体,图谱

章小麦脱水素 WZY1-2 干扰基因的用高速金属微粒将外源基因导入受体细胞的进入细胞后，其携带的外源基因得以表达，同8)。基因枪法的优点是受体类型广泛，既可以高度可控。缺点是外源基因拷贝数多，使外般低于 1%）、转化体系不稳定和成本高等(郑引 1 号为供试材料，供试材料播种于陕西杨株的生长状况好坏对能否成功转化是至关重株保留 5 个分蘖。取幼胚进行试验。小麦颖水。pMD18-T 载体（购自 Takara 公司，图谱实验保存，图谱见图 2-2）。各种限制性内切

植物表达载体,选择试剂,琼脂凝胶,成分

图 2-2 pTCK303 植物表达载体Fig 2-2. pTCK303 plant expression vector储存液成分种基本培养基储存液的成分，包括大量元素、试剂、选择试剂和琼脂凝胶，以及最终使用表 2-1 大量元素S 大量(10×)/(g/L) L7 大量(10×)/(g/L)16.5 2.519.0 15.01.7 2.03.7 3.54.5 4.5121℃灭菌 20min 121℃灭菌 20mi4℃ 4℃

电泳图,小麦,电泳,转录产物

到合适大小(3~4 片叶)时，取叶片提取基因组 DCR 鉴定为阳性，将阳性苗移到 13cm2大小的塑成熟需要 3~4 个月。基因小麦中 wzy1-2 基因表达量的检测RNA诱导的外源基因是否影响目的基因的mRN特异性地针对目的基因 mRNA 而设计的，用于因的转录产物水平(王莉等. 2016)。为验证试验可(三个 cDNA)。分析总 RNA 的提取结果（图 2-3）表明，Trizol 法提取的小麦总 RNA带），无明显降解，可以满足反转录的要求。M 1 2

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