节律基因BMAL1在IL-1β诱导的炎性髁突软骨细胞中的作用探讨

发布时间：2020-10-01 14:11

　　目的:在小鼠的部分软骨中已经发现节律现象的存在,然而对于时钟节律在颞下颌关节(TMJ)中的作用及其及其机制我们尚仍不清楚。本研究旨在探究时钟基因芳烃受体核转位因子样蛋白1(ARNTL/BMAL1)在炎性介质白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的炎性大鼠颞下颌关节髁突软骨细胞中的作用及其可能存在的分子机制。方法:严格无菌的环境之下,从Wister大鼠的双侧颞下颌关节中取出髁突软组织,并用含双抗的磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗两次,然后将剥离下来的髁突软骨切成1mm3大小的组织块,在37℃条件下置于0.25%的胰蛋白酶中消化30min,然后再加入0.2%Ⅱ型胶原酶。待消化1-2h后,分离并培养原代髁突软骨细胞,倒置光学显微镜下观察软骨细胞的增殖和形态,并通过观察细胞的形态、甲苯胺蓝染色法以及Ⅱ型胶原免疫荧光染色法来鉴定软骨培养结果。将培养至第二代姴突软骨细胞随机分成5组,分别用Ong/ml、lng/ml、5ng/ml、10ng/ml和100ng/ml浓度的IL-1β处理24小时。检测β-连环蛋白(β-catenin)、BMAL1、Ⅱ 型胶原蛋白(collagenⅡ,COL2)、蛋白多糖(Aggrecan,AGG)的mRNA表达量及蛋白含量的变化,观察节律基因BMAL1在IL-1β诱导下的炎性髁突软骨细胞中的表达变化,并选出能够引起髁突软骨细胞炎症状态的最佳的IL-1β浓度。然后再取第二代髁突软骨细胞,将其随机分为4组,分别是:对照组,软骨细胞不做任何处理;IL-1β组,将软骨细胞用浓度为10ng/ml的IL-1β处理24h;空白质粒组,在软骨细胞中加入空载质粒孵育24h;BMAL1小干扰RNA(BMAL1 siRNA)组,将软骨细胞加入含BMAL1siRNA的干扰质粒转染后孵育24h。荧光显微镜镜下观察BMAL1 siRNA的转染情况。用Western印迹方法检测各组BMAL1、β-catenin、COL2和AGG的蛋白表达变化。用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测 BMAL1、β-catenin、COL2 和 AGG 的 mRNA 的表达变化。结果:(1)大鼠颞下颌关节髁突软骨细胞成功提取并培养后,显微镜下观察可见正常体外软骨细胞形态呈规则的小圆形。孵育1天后,软骨细胞大部分贴壁成功,显微镜下观察可见细胞形态呈多边形或星形;软骨细胞培养4-5天后,镜下可观察到细胞呈“铺路石”样排列。一次传代之后,贴壁细胞生长的速度加快;通过甲苯胺蓝染色,发现髁突软骨细胞呈紫红色,背景呈淡蓝色;II型胶原免疫荧光染色,胞浆内可见有棕黄色颗粒(2)结果表明:随着IL-1β浓度的改变,髁突软骨细胞中COL2、AGG、β-catenin、BMAL1的表达均出现不同程度的改变,在IL-1β浓度为10ng/ml时,对髁突软骨细胞的COL2和AGG的表达效果影响最为明显,而且经过IL-1β(10ng/mL)诱导的髁突软骨细胞中BMAL1的表达显著降低。(3)在下调了 BMAL1的表达后,Wnt/β-catenin经典信号通路的关键蛋白β-catenin的表达增加,而COL2和AGG的表达量显着降低,TMJ呈现出类似骨关节炎(OA)样的改变。结论:节律基因在颞下颌关节髁突软骨细胞中发挥重要作用。在IL-1β诱导的体外骨关节炎模型中抑制了节律基因BMAL1的表达;而另一方面节律性基因BMAL1表达的失衡会导致髁突软骨细胞动态平衡的紊乱,从而引起TMJ出现OA样变化,表明BMAL1可能对软骨细胞有潜在的保护作用,而且这种改变可能通过Wnt/β-catenin信号通路发挥作用。本实验初步探讨了节律基因在颞下颌关节髁突软骨细胞中的重要作用,为TMJ-OA的发生发展机制提供了潜在的研究方向,但需要更多的临床研究来证实这一效果。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R782.6
【部分图文】：

软骨细胞,发生形态学,软骨原,形态学特点

软骨原代细胞提取、分离与培养步骤与大部分组织细胞步骤基们获得的软骨细胞生长状况良好，形态正常，增殖旺盛，并且用免疫细胞化学染色鉴定了髁突软骨细胞。逡逑外进行髁突软骨细胞的培养过程中，我们发现第二代细胞形态良而在软骨细胞培养４代之后发生形态学的改变，出现去分化的现四代以内的髁突软骨细胞，软骨细胞的形态学特点和生物学特性，且能够稳定的表达，因此可以用于本实验研究。逡逑

节律基因BMAL1在IL-1β诱导的炎性髁突软骨细胞中的作用探讨

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节律基因BMAL1在IL-1β诱导的炎性髁突软骨细胞中的作用探讨

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【参考文献】