菊花抗白色锈病相关基因CmDREBa-2的克隆及表达分析
发布时间：2020-10-12 07:40
菊花不仅是世界范围重要的观赏花卉,而且在医药、化工等方面具有重要的应用价值,其已成为我国花卉产业中的支柱力量。菊花白色锈病是一种在世界范围内广泛传播的菊花病害,该病害不仅严重影响菊花的生长发育与生产,而且极大的限制了菊花的推广与应用。目前,对于菊花白色锈病的研究主要集中于抗病品种的筛选,化学药剂防治及病理研究等方面,而在分子生物学方面的研究较少,尤其是抗病相关基因的研究更少。在前期研究的基础上,本研究克隆得到了与菊花抗白色锈病相关的基因CmDREBa-2,并进行了表达分析与载体构建,为进一步了解菊花白色锈病的分子机制奠定了基础,也为培养抗病新品种提供了候选基因。1.根据转录组数据,利用RACE和RT-PCR技术克隆得到一个DREB类基因。该基因cDNA全长834bp,基因的开放阅读框有291 bp,编码96个氨基酸;氨基酸序列分析表明,该基因含有1个AP2结构域,并且结构域中第十四位氨基酸为DREB家族标志的缬氨酸(V),氨基酸序列比对发现该蛋白的AP2结构域与已公布的CmDREBa蛋白一样,第十九位都为组氨酸(H),而不是大部分DREB蛋白含有谷氨酸(E),且氨基酸进化树分析表明该蛋白与CmDREBa蛋白同源关系最近,因此将此基因命名为CmDREBa-2。并用ProtParam对该基因编码的蛋白进行了理化性质分析,结果表明,该蛋白相对分子质量为11159.04,理论等电点11.34,氨基酸序列中精氨酸(Arg)的使用率最高,占14.6%,蛋白分子式为C_(491)H_(806)N_(160)O_(130)S_4;该蛋白,为不稳定、亲水性蛋白;亚细胞定位预测结果显示,该蛋白于细胞核中发挥作用。2.采用实时荧光定量分析了CmDREBa-2基因的表达模式,白色锈病病原菌处理后该基因在叶子中的表达量最高,和白色锈病危害菊花的部位相同;在菊花白色锈病诱导下,CmDREBa-2基因在高抗品种‘C029’中的表达量出现明显变化,在6h达到峰值,并且整体表达量高于对照组;激素处理结果表明,CmDREBa-2基因能够响应乙烯利(ETH)、水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导,说明该基因通过多种途径参与菊花抵御白色锈病的调节;非生物胁迫处理表明,CmDREBa-2基因受干旱,盐,高温和低温的诱导,但对干旱最不敏感,对高温最为敏感。3.我们构建了以pBI-121为基础表达载体的CmDREBa-2基因超表达载体pBI-121-CmDREBa-2,通过菌液PCR和双酶切验证了载体的正确性,并转化农杆菌EHA105感受态,为下一步转化植株奠定基础;还构建了以AP2结构域上游175bp片段为干扰片段,pTRV1和pTRV2为载体的沉默表达载体,同样验证其正确性后转化农杆菌备用。
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S436.8
【部分图文】：
性有重要的作用。但是研究发现在不含有 ABA 应答受体的拟南、低温和高盐等胁迫诱导下也能表达，已发现的该类基因包括 rd47 等（Shinozaki et al.，2000）。DREB 转录因子能与顺势作用元件而激活胁迫应答基因。最初的研究表明 DRE/CRT 元件含有 ABA号转导途径，但后来研究发现 cor78a、rd29A 启动子的 DRE/CRT 应答元件，但是受 DREB 转录因子调控的基因中含有 DRE/CRT明 DREB 转录因子在调控抗逆基因时存在非依赖 ABA 信号转导极大增强了植物对逆境胁迫的耐受性。在的研究成果显示，大部分已发现的 DREB 转录因子均能 DRE性结合（高世庆 等，2005）。有的 DREB 转录因子（A-1 和 A途径中不用 ABA；有的则需要通过 ABA 途径实现对抗逆基因的T 顺势作用元件在参与胁迫应答过程中，存在着依赖 ABA 信号转 信号转导途径，两者之间通过一些具有相同组分的物质紧密的联内形成一个复杂而完备的逆境胁迫应答网络，使得植物的逆境胁 等，2017）（图 1-1）。
第一章 前言 CmYB8 基因发现，转基因植株比野生型植株的花期大为延迟，沉默该基为提前，并且在沉默 CmYB8 基因株系中，超表达 cmo-MIR156 基因发现得正常，从而确定该 CmYB8 基因通过调控 cmo-MIR156 基因调控花期。究目的与意义是我国传统名花，在我国花卉产业中占据重要位置。菊花白色锈病给菊花造成重大影响，培育抗白色锈病品种是菊花产业健康发展的重要一步。本菊花 DREB 转录因子基因，并对其进行生物信息学分析、表达模式分析和研究其在菊花抵御白色锈病过程中如何调控抗逆基因提供理论基础，对菊分子抗病机制有更深入的认识，并且为进一步通过功能验证寻找到能用于病基因打下基础。
转录组序列验证引物e transcriptome sequence primersB055-FB055-RATGTTGGCTTCACAAACCCGAGGACTGCGGGATAGG5′ RACE 特异性引物ene specific primers for 5′ RACEGSP1GSP2GSP3CAGCGGTGTCATGTGTACTTCCTACTCCTTACACCTGGGTGTCGTGTCTCCTTG3′ RACE 特异性引物ene specific primers for 3′ RACEC038-1C038-2ACACATGACACCGCTGACATGGCAATGAGAGGTCGATCCGCGTGTTTA特异扩增引物ecificamplification primerCmDREBa-2-FCmDREBa-2-RATGCATATCGAATCACAATACCTTCTAAAAACACCTCAACGACATGTC结果与分析 菊花总 RNA 提取质量对所提取的菊花总 RNA，进行 10%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图 2-1 所示，明确清晰分别为 18 S 和 28 S，28 S 亮度约为 18 S 的 2 倍，并且经测定 OD260/OD在 2.0 左右说明 RNA 提取质量较好，可以用于下一步的试验。
【相似文献】
本文编号：2837852
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S436.8
【部分图文】：
性有重要的作用。但是研究发现在不含有 ABA 应答受体的拟南、低温和高盐等胁迫诱导下也能表达，已发现的该类基因包括 rd47 等（Shinozaki et al.，2000）。DREB 转录因子能与顺势作用元件而激活胁迫应答基因。最初的研究表明 DRE/CRT 元件含有 ABA号转导途径，但后来研究发现 cor78a、rd29A 启动子的 DRE/CRT 应答元件，但是受 DREB 转录因子调控的基因中含有 DRE/CRT明 DREB 转录因子在调控抗逆基因时存在非依赖 ABA 信号转导极大增强了植物对逆境胁迫的耐受性。在的研究成果显示，大部分已发现的 DREB 转录因子均能 DRE性结合（高世庆 等，2005）。有的 DREB 转录因子（A-1 和 A途径中不用 ABA；有的则需要通过 ABA 途径实现对抗逆基因的T 顺势作用元件在参与胁迫应答过程中，存在着依赖 ABA 信号转 信号转导途径，两者之间通过一些具有相同组分的物质紧密的联内形成一个复杂而完备的逆境胁迫应答网络，使得植物的逆境胁 等，2017）（图 1-1）。
第一章 前言 CmYB8 基因发现，转基因植株比野生型植株的花期大为延迟，沉默该基为提前，并且在沉默 CmYB8 基因株系中，超表达 cmo-MIR156 基因发现得正常，从而确定该 CmYB8 基因通过调控 cmo-MIR156 基因调控花期。究目的与意义是我国传统名花，在我国花卉产业中占据重要位置。菊花白色锈病给菊花造成重大影响，培育抗白色锈病品种是菊花产业健康发展的重要一步。本菊花 DREB 转录因子基因，并对其进行生物信息学分析、表达模式分析和研究其在菊花抵御白色锈病过程中如何调控抗逆基因提供理论基础，对菊分子抗病机制有更深入的认识，并且为进一步通过功能验证寻找到能用于病基因打下基础。
转录组序列验证引物e transcriptome sequence primersB055-FB055-RATGTTGGCTTCACAAACCCGAGGACTGCGGGATAGG5′ RACE 特异性引物ene specific primers for 5′ RACEGSP1GSP2GSP3CAGCGGTGTCATGTGTACTTCCTACTCCTTACACCTGGGTGTCGTGTCTCCTTG3′ RACE 特异性引物ene specific primers for 3′ RACEC038-1C038-2ACACATGACACCGCTGACATGGCAATGAGAGGTCGATCCGCGTGTTTA特异扩增引物ecificamplification primerCmDREBa-2-FCmDREBa-2-RATGCATATCGAATCACAATACCTTCTAAAAACACCTCAACGACATGTC结果与分析 菊花总 RNA 提取质量对所提取的菊花总 RNA，进行 10%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图 2-1 所示，明确清晰分别为 18 S 和 28 S，28 S 亮度约为 18 S 的 2 倍，并且经测定 OD260/OD在 2.0 左右说明 RNA 提取质量较好，可以用于下一步的试验。
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本文编号：2837852
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