转Haace1基因hpRNA烟草植株的获得及棉铃虫RNAi分析
发布时间：2020-10-13 02:33
棉铃虫(Helicoverpa armigera)是重要的农业害虫,近年来棉铃虫的防治问题引起广泛的关注。本研究以棉铃虫体内乙酰胆碱酯酶基因为对象,通过转基因手段获得表达Haace1基因的hp RNA植株,以探究其抗虫价值。另外,构建酵母hp RNA表达载体,与细菌表达系统(L4440/HT115)进行的饲喂dsRNA RNAi实验进行对比,探究酵母表达系统是否适合用于筛选RNAi靶标基因。具体内容如下:1.获得转Haace1基因烟草及遗传分析将植物表达载体p RNAi-GG-ace1f、p RNAi-GG-ace1r转化到农杆菌LBA4404中,随后农杆菌菌液侵染烟草外植体,经过植物组织培养技术获得再生苗,卡那抗性筛选和PCR验证后,共获得13株T0代Haace1f转基因烟草和9株T0代Haace1r转基因烟草;通过卡那抗性对T1代转基因烟草进行抗性苗和白化苗的统计,结果显示:5株T0代Haace1f转基因烟草中,有4株其后代卡那抗性遵循孟德尔3:1分离比,由此推测其为单拷贝插入,一株分离比为2.08:1,不符合孟德尔基因遗传规律;5株Haace1r转基因烟草,都符合孟德尔3:1的分离比,推测其都为单拷贝插入。2.转基因烟草抗虫性分析取新鲜的转基因烟草叶片喂食棉铃虫二龄幼虫,野生型叶片作对照,每隔一定时间观察叶片咬噬情况和幼虫生长状况,RT-qPCR检测幼虫体内Haace1基因表达情况。结果表明,Haace1f转基因烟草和Haace1r转基因烟草对幼虫体内Haace1基因表达均有抑制效果,并且Haace1r转基因烟草的抑制效果更显著。3.酵母和大肠杆菌dsRNA表达载体的Feeding-based RNAi分析酵母hp RNA表达载体的构建是将植物表达载体p RNAi-GG-ace1f质粒上的目的片段插入到p YES2质粒上,并转化到酵母INVSc1感受态中。酵母菌液饲喂棉铃虫,与大肠杆菌dsRNA表达载体的干涉效果进行对比,RT-qPCR结果分析,表达dsRNA的酵母菌对目的基因的抑制效果不明显,低于大肠杆菌的抑制效果。以上研究为以Haace1基因为靶标的植物基因工程和棉铃虫防治提供一些参考。
【学位单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S433;Q943.2
【部分图文】：
第 1 章 文献综述第 1 章 文献综述1.1 乙酰胆碱酯酶研究进展乙酰胆碱(Acetycholine，ACh)是一种神经递质，存在于神经细胞的小泡中由突触前膜释放，与突触后膜上的受体结合；乙酰胆碱酯酶（AcetylcholinestraAChE）能够在 ACh 发挥作用后水解其为胆碱和乙酸，使它丧失对突触后膜的奋作用[1]，胆碱大部分能够再次进入突触前膜，重新生成为乙酰胆碱分子。
图 1.2 RNAi 的三种类型 （Lim，2016）Fig.1.2 Three types of RNAiAi 导入方法 实验中 dsRNA 进入虫体内主要有三种方法：注射法最早在秀丽隐杆线虫中使用显微注射法注射 dsRNA组信息的公布，RNAi 技术运用广泛，这一技术已经运用，但是基因沉默效果参差不齐[43]。基于浸泡法因功能信息，适用于大规模的基因功能筛选，但 ds对于不易吸收 dsRNA 的昆虫来说，基因沉默效率极用的范围是有限的[44-45]。昆虫中导入 dsRNA 的一种重要方法。1998 年，Tim表达的 dsRNA 对秀丽隐杆线虫进行基因沉默，此后泛应用。目前主要有三种饲喂方法：第 1 种是直接喂
图 1.3 实验设计路线Fig.1.3 Experiment design本研究主要包括下面几部分：1. 获得 Haace1 转基因烟草及遗传分析：植物表达载体 pRNAi-GG-ace1f、pRNAi-GG-ace1r 转化到农杆菌感受态 LBA4404 中，农杆菌菌液侵染无菌的烟草外植体，然后通过植物组织培养得到再生苗，即 T0代转 Haace1 基因烟草，卡那抗性筛选和 PCR 验证，并对结果均为阳性的 T0代烟草的种子进行遗传分析。2.转基因烟草对棉铃虫的基因沉默效果：取新鲜的转基因烟草叶片喂食棉铃虫二龄幼虫，野生型叶片作对照，每隔一定时间观察叶片咬噬情况和幼虫生长状况，RT-qPCR 检测幼虫体内 Haace1 基因表达情况。3. 酵母和大肠杆菌 dsRNA 表达载体的 Feeding-based RNAi 分析：大肠杆菌dsRNA 表达系统（L4440/HT115）由实验室提供，酵母 hpRNA 表达载体的构建是通过设计合适的酶切位点，将 pRNAi-GG-ace1f 与 pYES2 质粒酶切连接，构成
【参考文献】
本文编号：2838615
【学位单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S433;Q943.2
【部分图文】：
第 1 章 文献综述第 1 章 文献综述1.1 乙酰胆碱酯酶研究进展乙酰胆碱(Acetycholine，ACh)是一种神经递质，存在于神经细胞的小泡中由突触前膜释放，与突触后膜上的受体结合；乙酰胆碱酯酶（AcetylcholinestraAChE）能够在 ACh 发挥作用后水解其为胆碱和乙酸，使它丧失对突触后膜的奋作用[1]，胆碱大部分能够再次进入突触前膜，重新生成为乙酰胆碱分子。
图 1.2 RNAi 的三种类型 （Lim，2016）Fig.1.2 Three types of RNAiAi 导入方法 实验中 dsRNA 进入虫体内主要有三种方法：注射法最早在秀丽隐杆线虫中使用显微注射法注射 dsRNA组信息的公布，RNAi 技术运用广泛，这一技术已经运用，但是基因沉默效果参差不齐[43]。基于浸泡法因功能信息，适用于大规模的基因功能筛选，但 ds对于不易吸收 dsRNA 的昆虫来说，基因沉默效率极用的范围是有限的[44-45]。昆虫中导入 dsRNA 的一种重要方法。1998 年，Tim表达的 dsRNA 对秀丽隐杆线虫进行基因沉默，此后泛应用。目前主要有三种饲喂方法：第 1 种是直接喂
图 1.3 实验设计路线Fig.1.3 Experiment design本研究主要包括下面几部分：1. 获得 Haace1 转基因烟草及遗传分析：植物表达载体 pRNAi-GG-ace1f、pRNAi-GG-ace1r 转化到农杆菌感受态 LBA4404 中，农杆菌菌液侵染无菌的烟草外植体，然后通过植物组织培养得到再生苗，即 T0代转 Haace1 基因烟草，卡那抗性筛选和 PCR 验证，并对结果均为阳性的 T0代烟草的种子进行遗传分析。2.转基因烟草对棉铃虫的基因沉默效果：取新鲜的转基因烟草叶片喂食棉铃虫二龄幼虫，野生型叶片作对照，每隔一定时间观察叶片咬噬情况和幼虫生长状况，RT-qPCR 检测幼虫体内 Haace1 基因表达情况。3. 酵母和大肠杆菌 dsRNA 表达载体的 Feeding-based RNAi 分析：大肠杆菌dsRNA 表达系统（L4440/HT115）由实验室提供，酵母 hpRNA 表达载体的构建是通过设计合适的酶切位点，将 pRNAi-GG-ace1f 与 pYES2 质粒酶切连接，构成
【参考文献】
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1 陈仲;廖维华;王静澄;高凯;孙吉;安新民;;影响农杆菌介导的杨树遗传转化技术的因素[J];植物生理学报;2014年08期
2 赵丹;赵德刚;李岩;;EuFPS基因表达载体构建及对杜仲遗传转化的研究[J];基因组学与应用生物学;2009年01期
3 曾凡锁,詹亚光;转基因植物中外源基因的整合特性及其研究策略[J];植物学通报;2004年05期
4 姜兴印,王开运,仪美芹;棉铃虫人工饲料概述[J];昆虫知识;2000年03期
本文编号：2838615
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