EphA3基因通过启动子区甲基化使其在结直肠癌中表达下调的研究

发布时间：2020-10-15 02:34

　　 目的:EphA3基因是人类最大受体酪氨酸激酶家族Eph(erythropoietin-producing human hepatocellular carcinoma,产促红细胞生成素肝细胞癌受体)基因的成员之一,参与了生长、发育和肿瘤的发生、进展和转移等方面。探讨EphA3在结直肠癌中的表达与临床病理资料的关系,以及对结直肠癌细胞生物学行为的影响。方法:本研究检测了四种肠癌细胞系、一种正常肠上皮细胞系和一组结直肠癌(164例包括肿瘤和正常组织)石蜡固定的组织标本中EphA3蛋白表达水平,分析了EphA3表达与临床病理指标之间的相关性。为了探索EphA3表达下调的分子机制,采用甲基化特异性PCR检测了四种肠癌细胞系中EphA3基因启动子区CpG岛的甲基化状态;基因测序法分析EphA3四种常见的体细胞突变;定量PCR和荧光原位杂交技术(FISH)分析EphA3基因拷贝数情况。进一步转染EphA3质粒到EphA3表达丢失的HT29肠癌细胞,通过细胞增殖、凋亡、侵袭力等体外实验,分析EphA3在肠癌细胞中的功能。结果:EphA3蛋白在四种肠癌细胞系中全部丢失;组织中,EphA3在大多数肠癌组织中表达明显低于在正常肠黏膜组织中的表达(P0,001)。将肠癌组织中EphA3免疫组织化学染色的评分与对应的同一患者来源的正常肠黏膜免疫组化评分相比较,EphA3在82/164(50%)的肠癌肿瘤标本中表达下调,在52/164(31.7%)肠癌肿瘤标本中无差异性,在30/164(18.3%)肠癌组织标本中表达上调。EphA3的表达水平与淋巴结转移负相关(P=0.014,r_s=-0.192),与TNM分期负相关(P=0.001,r_s=-0.260)。EphA3下调表达多见于老年人(P=0.013,r_s=0.193)。MS-PCR在四种肠癌细胞系中扩增出甲基化产物,未扩增出非甲基化产物,显示存在EphA3启动子区CpG岛的甲基化。EphA3基因突变在四种肠癌细胞系中未被检出。EphA3的基因拷贝数包括缺失和扩增在四种肠癌细胞系中也没有发现异常。不表达EphA3的肠癌细胞HT29在转染EphA3质粒后,与空白对照和阴性对照组比较发现,细胞增殖能力减弱、侵袭力降低以及凋亡率上升,并具有明显统计学差异(P0.05)。结论:EphA3在多数结直肠癌中表达下调,EphA3启动子区CpG岛甲基化可能是其表达下调的分子机制。EphA3的表达水平与淋巴结转移和TNM分期负相关。体外实验表明,EphA3在肠癌细胞中起着抑癌基因作用。EphA3可能是一个潜在的结直肠癌淋巴转移的预测指标,为结直肠癌靶向治疗提供新的实验依据。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.34
【部分图文】：

此结果表明本项目使用的 EphA3 抗体具有特异性。（×400）2、EphA3 在肠癌细胞系和正常肠上皮细胞系中的表达免疫细胞化学和 western blot 分析 EphA 3 蛋白在结肠癌细胞和正常肠上皮中的表达水平。EphA3 在肠癌 SW 480、SW 620、HT 29 和 HCT 116 细胞中，蛋白表达极低，而在正常肠上皮细胞 NCM460 中表达强阳性。22

染色呈现棕褐色。EphA3 在肠癌细胞系 SW480、SW620 和 HCT116中微弱表达，在 HT29 中为阴性。下图为正常肠上皮细胞和肠癌细胞系 westernblot 检测结果，与细胞免疫化学染色结果一致。3、EphA3 在结直肠癌组织和配对的正常肠粘膜细胞中的表达本项目共利用免疫组化染色检测了 164 例结直肠癌组织标本，分别观察比较分析了同一患者组织切片上肿瘤细胞和癌旁正常黏膜细胞中 EphA3 受体蛋白的表达水平。EphA3 在正常黏膜和肿瘤组织中呈现多样的表达方式，即从阴性到弱阳性、中等强度阳性、最后到强阳性。但是，在正常黏膜细胞中，强阳性的比例明显高于肿瘤细胞中强阳性的数量。EphA3 蛋白在正常黏膜和肿瘤细胞中表达具有明显差异性，在正常黏膜中总体为高表达，在肿瘤细胞中总体为低表达（P<0.001）。总之，EphA3 在肠癌细胞中的表达与同一患者的正常黏膜细胞表达相

南京医科大学博士学位论文表 1. EphA3 在正常肠黏膜与肿瘤细胞的表达差异性分析EphA3 蛋白表达水平 P0/1+ 2+ 3+正常黏膜 50 50 64 < 0.001肿瘤 104 22 38
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本文编号：2841559