Lrg1基因敲除损伤小鼠睾丸睾酮产生与生精功能
发布时间：2020-10-16 09:08
目的:最近的流行病学数据表明,在过去的50年中,男性不育发病率在不断增加。男性不育的发病因素复杂,其具体机制尚待进一步研究。富亮氨酸α2糖蛋白1(Leucine-rich-alpha-2-glycoprotein 1,LRG1),是膜相关富亮氨酸重复序列家族成员之一。LRG1基因在人卵巢癌、肝癌、肺癌等恶性肿瘤中都呈现异常表达。我们前期研究发现Lrg1基因在小鼠睾丸中有表达,提示其可能参与雄性生殖过程。因此本课题旨在探究Lrg1在小鼠睾丸组织中的定位和表达情况,通过敲除小鼠模型研究Lrg1基因在小鼠雄性生殖中的生物学功能,并对敲除小鼠睾丸转录谱表达变化进行分析,以揭示Lrg1基因参与小鼠雄性生殖功能的调控机制。实验方法:1.免疫荧光和Western Blot方法检测Lrg1基因的表达与定位。2.免疫荧光、PCR和Western Blot方法鉴定敲除小鼠Lrg1基因的表达情况。3.比较成年野生型对照小鼠和敲除小鼠体重、睾丸重量、精子数量、精子活力、精子形态以及睾丸形态学改变情况。4.通过ELISA方法检测成年野生型对照小鼠和敲除小鼠血清睾酮和LH水平(n=6)。5.通过高通量测序方法,筛选出成年敲除小鼠与野生型对照小鼠睾丸组织中的差异表达基因,生物信息学方法进行分析。实验结果:1.Western Blot和免疫荧光结果显示,LRG1表达于小鼠睾丸组织,主要定位在精原细胞和初级精母细胞中。2.免疫荧光、PCR和Western Blot结果显示Lrg1敲除小鼠模型构建成功。3.敲除小鼠与野生型对照小鼠相比,体重、睾丸重量和附睾重量无明显差异,但是敲除小鼠的精子数量和活力明显低于野生型小鼠。睾丸组织形态学分析显示敲除小鼠退化生精细胞数量增加。4.ELISA检测发现,敲除小鼠与野生型对照小鼠相比血清LH水平升高,睾酮水平降低。5.高通量测序结果显示差异基因主要集中在减数分裂、有丝分裂、染色体分离、精子发生、受精和代谢过程。此外,睾丸Lrg1敲除后有48个C2H2型锌指蛋白家族成员表达下调,17种miRNAs表达变化,说明睾丸的转录调控过程发生障碍。实验结论:我们研究揭示Lrg1基因在小鼠睾丸中参与调节精子发生与睾酮合成。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R698.2
【部分图文】：
19spr/Cas9 技术敲除 Lrg1 基因小鼠鉴定。(A) Lrg1 基因序列中 gRNA 靶定位记；gRNA 序列用红色下划线标记，PAM 序列标记为红色。 (B) Lrg1 敲除测序结果。(C) Lrg1 敲除小鼠和野生型小鼠睾丸组织中 LRG1 蛋白 WB rispr/Cas9-mediated Lrg1 gene modification in mice. (A) Schematic illustratarget site in the Lrg1 gene (blue arrow); the gRNAsequence is underlined
重庆医科大学硕士研究生学位论文and the protospacer adjacent motif (PAM) sequence of the gRNA target site is marked in red.(B) Sequencing results from Lrg1 KO and WT mice. (C) Western blot analysis of LRG1expression in homogenized testis tissue from WT and Lrg1 KO mice.2.3 小鼠睾丸组织免疫荧光结果随后小鼠睾丸组织免疫荧光结果显示（图 2），野生型小鼠睾丸的精原细胞和精母细胞中发现有 LRG1 表达，而敲除小鼠睾丸中 LRG1 表达不明显。说明敲除小鼠模型成功建立。
图 3：野生(A)和 Lrg1 (B)敲除小鼠精子形态 HE 染色。Fig. 3: Sperm morphology in WT (A) and Lrg1 knockout (B) male mice. Sections werstained with hematoxylin and eosin.1 野生和 Lrg1敲除小鼠体重、睾丸和附睾尾重量、附睾尾精子计数以及精子活力分析able 1 Body weight, testis weight, epididymal weight, epididymal sperm counts, and spemotility for WT and Lrg1 knockout mice.WT Lrg1-/-ody weight(g) 30.32 ± 2.07 31.93 ± 2.36
【参考文献】
本文编号：2843058
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R698.2
【部分图文】：
19spr/Cas9 技术敲除 Lrg1 基因小鼠鉴定。(A) Lrg1 基因序列中 gRNA 靶定位记；gRNA 序列用红色下划线标记，PAM 序列标记为红色。 (B) Lrg1 敲除测序结果。(C) Lrg1 敲除小鼠和野生型小鼠睾丸组织中 LRG1 蛋白 WB rispr/Cas9-mediated Lrg1 gene modification in mice. (A) Schematic illustratarget site in the Lrg1 gene (blue arrow); the gRNAsequence is underlined
重庆医科大学硕士研究生学位论文and the protospacer adjacent motif (PAM) sequence of the gRNA target site is marked in red.(B) Sequencing results from Lrg1 KO and WT mice. (C) Western blot analysis of LRG1expression in homogenized testis tissue from WT and Lrg1 KO mice.2.3 小鼠睾丸组织免疫荧光结果随后小鼠睾丸组织免疫荧光结果显示（图 2），野生型小鼠睾丸的精原细胞和精母细胞中发现有 LRG1 表达，而敲除小鼠睾丸中 LRG1 表达不明显。说明敲除小鼠模型成功建立。
图 3：野生(A)和 Lrg1 (B)敲除小鼠精子形态 HE 染色。Fig. 3: Sperm morphology in WT (A) and Lrg1 knockout (B) male mice. Sections werstained with hematoxylin and eosin.1 野生和 Lrg1敲除小鼠体重、睾丸和附睾尾重量、附睾尾精子计数以及精子活力分析able 1 Body weight, testis weight, epididymal weight, epididymal sperm counts, and spemotility for WT and Lrg1 knockout mice.WT Lrg1-/-ody weight(g) 30.32 ± 2.07 31.93 ± 2.36
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 白小英;金平;;LRG1及CA125在上皮性卵巢癌血清中的表达及其临床意义[J];现代妇产科进展;2013年02期
2 徐刚;武明花;李桂源;;神经系统中富亮氨酸重复序列跨膜蛋白的功能研究进展[J];生物化学与生物物理进展;2012年04期
3 郭睿,薛社普,韩代书;精子发生相关基因的研究进展[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2004年01期
本文编号：2843058
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