ITGA5基因shRNA慢病毒载体的构建及其对人肝癌Bel-7404细胞生物学功能的影响
发布时间：2020-10-17 01:18
目的构建整合素α5(integrinα5,ITGA5)基因sh RNA慢病毒载体及ITGA5基因稳定沉默的肝癌Bel-7404细胞系,检测ITGA5基因对Bel-7404细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移功能的影响。方法1.设计ITGA5基因的特异性sh RNA靶点,构建ITGA5基因sh RNA慢病毒载体并侵染Bel-7404细胞,构建基因稳定沉默细胞系。用含非特异性序列的病毒载体作为阴性对照,未转染的Bel-7404细胞作为空白对照。采用q PCR方法检测Bel-7404细胞中ITGA5的m RNA水平变化,Western Blot方法检测ITGA5蛋白水平的表达,以鉴定ITGA5基因沉默的效果。2.采用平板克隆形成实验、流式细胞术、Transwell、细胞划痕等实验方法检测ITGA5基因沉默后Bel-7404细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的变化。结果1.成功构建sh RNA-ITGA5慢病毒载体,侵染Bel-7404细胞,建立ITGA5稳定沉默细胞系,q PCR及Western blot鉴定ITGA5基因沉默组的m RNA及蛋白质表达水平均比空白、阴性对照组明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。2.平板克隆形成实验结果显示,基因沉默组比空白、阴性对照组的克隆形成率降低,差异具有统计学意义(P0.05);Transwell结果显示,基因沉默组细胞穿膜数比空白及阴性对照组显著降低,差异具有统计学意义(P0.05);细胞划痕结果显示,基因稳定沉默组24h、48h细胞划痕宽度均比比空白、阴性对照组宽,差异有统计学意义(P0.05);流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,基因沉默组比空白及阴性对照组细凋亡率增加,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:1.成功构建ITGA5基因sh RNA慢病毒表达载体及ITGA5稳定沉默的肝癌Bel-7404细胞细胞系。2.ITGA5可能通过影响肝癌细胞的增殖、凋亡、侵袭迁移从而促进肝癌转移。
【学位单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：
ITGA5-shRNA-1、ITGA5-shRNA-2、ITGA5-shRNA-3及阴性对照组ITGA5-shRNA-Negative细胞均可见明显的绿色荧光GFP，使用嘌呤霉素筛选后约99%的细胞呈现出绿色荧光（如图3），表明ITGA5的干扰序列及GFP基因已经整合到目的细胞中，稳定感染的细胞系构建成功。4.qPCR 和 Western blot 对稳定感染细胞系 Bel-7404 的沉默效果鉴定qPCR 检测 ITGA5 基因稳定沉默细胞系 Bel-7404 中 ITGA5 的 mRNA表达情况。结果表明，ITGA5-shRNA-1、ITGA5-shRNA-2、ITGA5-shRNA-3组的 mRNA 相对表达量分别为（n=3, x±s）：（10.7±3.7）%、（16.7±1.5）%、
Western Blot 验证 ITGA5 shRNA 慢病毒稳定感染细胞系 Bel-7404 A5 蛋白质的表达情况。用蛋白灰度分析软件分析各组蛋白的相对表（n=3，x±s），3 组 ITGA5 基因稳定沉默细胞系的 ITGA5 蛋白质表白、阴性对照组明显降低，结果均具有显著性差异（P＜0.05）(如未处理组（100±0.6）%与阴性对照组（96.4±0.4）%的 ITGA5 蛋白平无显著性差异（P=0.28）。综合上述 RT-PCR 和 Western blot 检测示：3 组 ITGA5 慢病毒干扰载体均有很好的沉默效果，选取沉默效的干扰组 ITGA5-shRNA-1 做后续实验的工具细胞。
.ITGA5 对 Bel-7404 细胞体外迁移能力的影响为揭示ITGA5对Bel-7404人肝癌细胞体外迁移能力的影响，利用细胞划实验检测ITGA5基因稳定沉默后划痕宽度变化。结果显示：细胞划痕24h、8h后，ITGA5基因稳定沉默组细胞划痕均比比空白、阴性对照组宽，差异统计学意义(P<0.05)。而空白组和阴性对照组之间无明显变化(如图7)。结说明ITGA5基因沉默可减慢肝癌细胞的迁移能力。
【参考文献】
本文编号：2844054
【学位单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：
ITGA5-shRNA-1、ITGA5-shRNA-2、ITGA5-shRNA-3及阴性对照组ITGA5-shRNA-Negative细胞均可见明显的绿色荧光GFP，使用嘌呤霉素筛选后约99%的细胞呈现出绿色荧光（如图3），表明ITGA5的干扰序列及GFP基因已经整合到目的细胞中，稳定感染的细胞系构建成功。4.qPCR 和 Western blot 对稳定感染细胞系 Bel-7404 的沉默效果鉴定qPCR 检测 ITGA5 基因稳定沉默细胞系 Bel-7404 中 ITGA5 的 mRNA表达情况。结果表明，ITGA5-shRNA-1、ITGA5-shRNA-2、ITGA5-shRNA-3组的 mRNA 相对表达量分别为（n=3, x±s）：（10.7±3.7）%、（16.7±1.5）%、
Western Blot 验证 ITGA5 shRNA 慢病毒稳定感染细胞系 Bel-7404 A5 蛋白质的表达情况。用蛋白灰度分析软件分析各组蛋白的相对表（n=3，x±s），3 组 ITGA5 基因稳定沉默细胞系的 ITGA5 蛋白质表白、阴性对照组明显降低，结果均具有显著性差异（P＜0.05）(如未处理组（100±0.6）%与阴性对照组（96.4±0.4）%的 ITGA5 蛋白平无显著性差异（P=0.28）。综合上述 RT-PCR 和 Western blot 检测示：3 组 ITGA5 慢病毒干扰载体均有很好的沉默效果，选取沉默效的干扰组 ITGA5-shRNA-1 做后续实验的工具细胞。
.ITGA5 对 Bel-7404 细胞体外迁移能力的影响为揭示ITGA5对Bel-7404人肝癌细胞体外迁移能力的影响，利用细胞划实验检测ITGA5基因稳定沉默后划痕宽度变化。结果显示：细胞划痕24h、8h后，ITGA5基因稳定沉默组细胞划痕均比比空白、阴性对照组宽，差异统计学意义(P<0.05)。而空白组和阴性对照组之间无明显变化(如图7)。结说明ITGA5基因沉默可减慢肝癌细胞的迁移能力。
【参考文献】
相关期刊论文 前4条
1 何彩霞;王亚婷;李鹏;郭亚妹;杨少奇;;整合素α5和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3在肝细胞癌中的表达及其临床意义[J];中华消化杂志;2017年01期
2 赵铁军;倪伟海;郑有芳;郭一孚;蒋欢乐;徐怡;;慢病毒载体及其介导的RNA干扰在基因治疗中的应用研究[J];浙江师范大学学报(自然科学版);2014年02期
3 李文宾;袁志强;吴敏丽;;RNA干扰应用研究现状[J];中学生物教学;2011年06期
4 曾林;孙岩松;胡仲明;;肝癌转移机制的研究进展[J];实用医药杂志;2006年01期
本文编号：2844054
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