森林草莓花青素下降突变体RAP基因的克隆与功能解析

发布时间：2020-10-23 22:52

　　 凤梨草莓(Fragaria×ananassa Duch.)是蔷薇科多年生草本植物,果实颜色鲜艳,果肉鲜美,营养丰富,深受消费者的喜爱。草莓果实中含有大量黄酮类物质,其中花青素是一种重要的水溶性色素,赋予草莓果实和叶柄鲜艳的颜色。花青素在内质网中合成,在液泡中积累。花青素合成途径已经较为清楚,而其转运机制却研究较少。本课题组通过ENU诱变白果森林草莓YW5AF7,获得一个叶柄花青素显著下降的突变体。本研究主要以此突变体和三种森林草莓野生型YW5AF7,Ruegen,H4为材料,通过遗传学分析、全基因组重测序、进化树分析、瞬时转化、稳定转化、表达模式分析等方法对致突变基因进行克隆和功能解析,首次报道了草莓中介导花青素转运的关键基因,具有重要的理论意义和应用价值。主要结果如下:1.通过ENU诱变获得一棵突变体,其叶柄和叶片花青素含量显著下降,命名为Reduced Anthocyanins in Petioles(rap)。野生型YW5AF7叶柄表面和维管束周围呈红色,而rap叶柄中相同部位没有红色色素的积累。与野生型相比,突变体叶柄中的总花青素含量显著下降,与表型观察一致。创建rap与YW5AF7回交F2代群体,其野生型与突变体植株的比率接近3:1,说明rap是由单基因隐性突变所致。通过混池基因组重测序数据分析发现gene31672第二个外显子上存在一个C到T的SNP,能够引起翻译提前终止,表明该基因是RAP候选基因。对F2群体中50个突变单株测序发现该SNP均纯合,进一步证明gene31672与表型连锁。此外,我们发现rap叶柄中RAP表达量显著下降,说明RAP转录本由于无意介导的衰变而降解。2.在森林草莓中,RAP有7个同源基因,同属于GST家族中的phi亚家族。这8个GST基因具有不同的表达模式。RAP在Ruegen果实中表达量最高,且随着果实成熟显著上调。对RAPpro::GUS转基因株系GUS活性分析表明RAP在叶柄表皮和维管束组织特异表达。在拟南芥突变体tt19-7中过表达RAP时,下胚轴、茎秆和叶片重新积累花青素,表明RAP是拟南芥中TT19的直系同源基因。3.将Ruegen与rap杂交,在66棵绿色叶柄的F2代植株中分离出一棵带有MYB10的纯和突变体材料(MYB10+;rap-),说明MYB10与RAP连锁。与野生型Ruegen相比,该交换单株果皮几乎不积累花青素,瘦果颜色也显著变浅,表明RAP是调控果实颜色的关键基因且位于MYB10下游。q RT-PCR检测表明RAP与MYB10有共表达趋势。HPLC分析表明MYB10+;rap-中各花青素成分显著低于MYB10+;RAP+,说明RAP转运花青素具有广谱性。4.瞬时转化实验表明,同时过表达RAP和MYB10能使rap果实重新积累花青素,而其它同源基因过表达却不能达到相同效果。烟草瞬时转化实验表明RAP、RAP-L1和RAP-L3-5定位于细胞质和细胞核,部分定位于液泡膜,而RAP-L2定位在叶绿体上。这些结果说明,除了表达水平调控,蛋白序列和亚细胞定位变化也是RAP同源基因功能分化的因素。此外,蛋白结构域置换实验表明RAP的N端与C端共同决定了花青素转运活性。5.在rap背景下稳定过表达RAP时,叶柄重新变红;根尖和雌蕊柱头等本来不积累花青素的部位也变红;果实变红,但不同于野生型且不依赖MYB10。用RNA干扰瞬时下调栽培草莓果实中RAP的表达水平,花青素含量显著下降。这些结果说明,RAP可作为草莓果实颜色育种的候选基因。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S668.4
【部分图文】：

花青素的基本结构母核Fig1-1Basicchemicalstructureofanthocyanins

森林草莓花青素下降突变体 RAP 基因的克隆与功能解析也很大，其中花青素含量丰富的果实有草莓、蓝莓、越桔等。研究证明，花青种类和含量由植物基因型与外界生长环境共同决定。 花青素的合成代谢分子机制.1 花青素合成途径中结构基因研究进展花青素在细胞质中合成，最终被运送到液泡中储存。花青素的合成过程比较复有多种代谢产物的参与，其合成的前体物质是苯丙氨酸。近年来，有关花青素的分子机制的研究已相对深入，影响花青素合成代谢的基因主要分为结构基因控基因两类。其中结构基因在花青素合成途径中编码了一系列生物合成酶，这成酶在各个生物中功能相对保守，如图 1-2所示。

森林草莓花青素下降突变体 RAP 基因的克隆与功能解析和 EGL3 等，WD40 蛋白包括 TTG1 等(P Li et al 2016)。其中，bHLH 与 R2R3-MYB的特定区域结合来识别 DNA 序列，WD40 可以与 bHLH 直接互作从而增强复合体的稳定性，R2R3-MYBs、bHLH、WD40 三者结合形成蛋白复合体(MBW)，共同调控相关结构基因的表达，从而促进花青素的合成，如图 1-3 A 所示。其他转录因子主要通过与 R2R3-MYB竞争 bHLH蛋白来调节花青素的生物合成，如图 1-3 B所示(Zhang et al 2013)。例如，在拟南芥中，MYBL2 和 JAZ 家族蛋白能与 bHLH互作从而抑制 MBW 的活性(Xie et al 2016)。此外，存在一部分转录因子通过通过与 MBW结合来负控制花青素的合成。例如，‘澳洲青苹’中分离出了 MdHB1 是一种 HD-Zip蛋白，MdHB1可将MdMYB、MdbHLH、MdTTG1或MBW复合体束缚在细胞质内，从而降低了 MdDFR、MdUFGT 的转录水平，抑制花青素的合成（姜永华 2017）。
【参考文献】

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本文编号：2853656