亚洲棉纤维发育关键基因GaHD1上游调控因子解析

发布时间：2020-10-26 06:31

　　 GaHD1基因为HD-ZIP IV转录因子家族成员,主要起信号转导作用,其最终的信号受体为纤维发育相关功能基因。已有的相关报道发现GaHD1是控制茸毛和纤维起始的关键调控基因,并受赤霉素(GA3)诱导(本项目研究基础)。为了探索GaHD1的上游调控基因,同时验证GaHD1是否为正反馈调节基因,我们运用生物信息学方法,提取GaHD1上游启动子调控区域,分析其中是否含有HD1基因结合的顺式作用元件L1box,并预测和验证了直接调控GaHD1的上游基因。主要结果如下:1.首先克隆得到了GaHD1基因启动子,生物信息学分析启动子区潜在的顺式作用元件,根据L1box存在的位置,克隆了不同长度的4条启动子片段(HD1-Pro-R1、HD1-Pro-R2、HD1-Pro-Intron、HD1-Pro-full Length),分别构建了这4种启动子片段与GUS报告基因融合的植物表达载体并转化拟南芥。GUS活性分析表明,4个启动子片段驱动GUS的表达情况有差异,其中,HD1-Pro-R1染色很淡,茎秆、叶片茸毛均无染色。HD1-Pro-R2颜色较深,叶片、茎秆茸毛均被染色,这可能是由于R2片段相较R1多了L1box,说明L1box是在茸毛中表达的非常重要的元件。HD1-Pro-Intron片段包括5’-UTR区域且只在叶片边缘有GUS染色,说明5’-UTR区有在叶片边缘特异性表达元件。HD1-Pro-full Length GUS活性极高,在几乎所有区域均表达。说明UTR部分的内含子元件可以使该启动子不仅可在叶片边缘特异性表达,还具有启动子增强作用。随后我们对转基因拟南芥叶片进行GUS活力检测,结果显示:HD1-Pro-R1和HD1-Pro-Intron GUS活力水平较低,而HD1-Pro-R2和HD1-Pro-full Length GUS活力水平很高,与染色结果一致,且达到显著水平。另外,我们将转HD1-Pro-full Length启动子的转基因拟南芥植株做石蜡切片,发现GUS活性在其茎和叶片表皮细胞中高亮表达。同时,我们用5μM GA3处理转基因拟南芥植株,结果显示,GA3处理后,HD1-Pro-R1和HD1-Pro-Intron GUS染色及其活力水平相较于处理前均几乎无变化,而HD1-Pro-R2和HD1-Pro-full Length因为含L1box,GUS活性均有所增加。这说明GA3能够诱导某些基因或转录因子起到结合L1box调控HD1基因表达的作用。2.体外验证GaHD1的上游调控转录因子,克隆了已知的与棉纤维发育相关的转录调节因子(GaHD1,GaHOX3,GaPDF2,GaMML9),分别将其与PCY载体融合,转化拟南芥原生质体,其中GaPDF2和GaMML9先前未研究过,我们对其进行了亚细胞定位的研究,结果发现这两个转录调节因子都在细胞核中表达。3.为了明确GaHD1,GaHOX3,GaPDF2,GaMML9这四个转录调节因子与GaHD1启动子的关系,本研究采用酵母单杂交方法。结果发现,GaHD1启动子能够与GaHD1,GaPDF2,GaMML9调节因子结合,不能与GaMML7,GaHOX3结合,说明GaHD1可以与自身基因结合;GaPDF2,GaMML9是HD1上游转录调节因子。4.利用烟草瞬时转化实验体内验证GaHD1的上游调控转录因子,结果发现,启动子HD1-Pro-R1和HD1-Pro-Intron,分别共转化GaHD1,GaHOX3,GaPDF2,GaMML9调节因子后GUS活力水平和单一启动子相比无明显变化;启动子HD1-Pro-R2和HD1-Pro-full Length含有L1box,分别共转化GaHOX3后GUS活力无显著变化,而分别共转化GaHD1,GaPDF2或GaMML9后烟草的GUS活力水平比单一启动子明显增强,说明GaHD1,GaPDF2,GaMML9能够结合到GaHD1启动子上并增强GaHD1基因表达,该试验进一步确认了HD1上游的调控因子。
【学位单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S562
【部分图文】：

图 1.3 HD-ZIP 家族蛋白结构HD：同源异型框；LZ：异亮氨酸拉链域; N-Term: N 末端一致序列; START: 脂质/类固醇结合受体; MEKHLA: 较保守的 MEKHLA 序列[61]Figure1.3 Schematic representation of the distinctive features exhibited by each HD-ZIP subfamilyHD: Homeodomain; LZ: Leucine-zipper; N-Term: N-terminus consensus; START: Steroidogenic acuregulatory protein-related lipid transfer domain; MEKHLA: Named after the highly conserved aminoacids Met, GLu, Lys, His, Leu,Ala1.3.1 HD-ZIP Ⅳ转录因子的结构特点HD-ZIP Ⅳ转录因子与 HD-ZIP Ⅰ、Ⅱ有很大差异，除了包含 HD-LZ 结构域外，包含一个类固醇敏感的脂质调节蛋白（START）结构域，C 末端序列高度保守。HD-ZIP Ⅳ转录因子可能存在于所有的陆生植物中，相关的研究已在拟南芥[66]，向日葵[67]，棉花[56]，番茄[68]，苹果[69]，玉米[70]，大米[71]，高粱[72]，挪威云杉[73]，石属植物[74]，苔藓类植物[75]等中，结果证实了 HD-ZIP Ⅳ转录因子活性与表皮发育和功能之间的关系。HD-ZIP Ⅳ因子与参与表皮层分化和发育的下游靶基因的启动子区

图 1.5 亚洲棉 sma-4(ha) 基因的遗传和物理定位A. SMA-4 和非洲棉 1 号的茎和种子; B. 光秆和光籽基因 sma-4(ha)的遗传定位，C. GaHD1基因在雷蒙德氏棉 scaffold 上的物理位置（兰色线条表示）Figure1.5 Genetic and physical localization of SMA-4 (ha) in G. arboreumA.The stems and seeds of SMA-4 and African cotton 1; B. Genetic localization of sm-4 (ha) gene;C. The location of GaHD1 gene in G. raimondii genome (blue line representation)亚洲棉 SMA-4 是一个无茸毛（光秆），无纤维（光籽，即无短绒也无皮棉纤维）的天然突变体（图 1A）[88,89]，非洲棉 1 号是一个有很密茸毛和长绒纤维的非洲棉常规品种（图 1A）。我们课题组前期用近 3000 个由上述两个亲本杂交产生的 F2单株组成的大群体，对光秆光籽突变体基因（sma-4(ha)）进行了精细定位，发现光秆和光籽共分离，并且被定位在 L.G.A3的中间区段（图 1B）[90]，与先前的研究报道基本相同。通过图位克隆和 DNA 序列分析等方法确定了 sma-4(ha)的候选基因（图 1C），发现该基因属于 HD-ZIP IV 基因家族成员，是含有一个 Homebox 结构域以及 START蛋白结构域的转录调节因子，为 GhHD1 在亚洲棉中的同源基因，命名为 GaHD1。通过野生型（亚洲棉 4 号）与突变体（SMA-4）之间 DNA 序列比对，我们发现 SMA-4

图 2.4.1 GaHD1 启动子引物设计图谱Figure 2.4.1 The primer design of GaHD1 promoter sequence2.4.2 PCR 分段扩增 GaHD1 启动子序列以 GaHD1 启动子 PCR 回收产物为 DNA 模板，进行 HD1 的分段克隆。具体法参照 2.2.3PCR 扩增 GaHD1 基因启动子全长。2.4.3 PCR 产物回收具体方法参照 2.2.4PCR 产物回收。2.5 分段克隆启动子与 GUS 融合载体的重组及鉴定将测序反馈回来的序列与全长启动子序列进行比对，将比对无误的 PCR 回收物利用核酸蛋白仪测定浓度。2.5.1 pCXSN1262 载体的准备2.5.1.1 pCXSN1262 载体pCXSN1262 具有 XcmⅠ酶切位点，XcmⅠ酶切后产生一个末端 T。载体构建图谱
【参考文献】

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2 蔡大润;李超;黄先忠;;陆地棉编码成花素同源基因GhFT1-A和GhFT1-D启动子的克隆及活性分析[J];石河子大学学报(自然科学版);2017年03期

3 胡海燕;刘迪秋;李允静;李阳;涂礼莉;;一个棉花纤维伸长期优势表达启动子pGhFLA1的克隆与鉴定[J];作物学报;2017年06期

4 郭育强;刘姣;符少萍;段瑞军;李瑞梅;姚远;胡新文;郭建春;;MeCWINV6酵母单杂交文库构建及其调控基因筛选[J];分子植物育种;2016年10期

5 赵存鹏;郭宝生;王凯辉;刘素恩;王兆晓;刘冬艳;耿军义;;通过转CaM基因提高了棉花抗寒性[J];棉花学报;2016年03期

6 霍琳;及晓宇;王玉成;;农杆菌介导的烟草瞬时表达试验条件优化[J];分子植物育种;2016年01期

7 孙蔓莉;孟玉玲;张强;黄桂艳;单卫星;;农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究[J];西北农业学报;2015年01期

8 匡政成;曾潜;赵燕;匡逢春;肖才升;陈浩东;李庠;李育强;张学文;;生长素响应报告基因转化棉花及GUS检测[J];棉花学报;2014年04期

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10 李锡花;吴嫚;于霁雯;张金发;范术丽;宋美珍;庞朝友;喻树迅;;棉花纤维发育早期RNA-Seq转录组分析[J];棉花学报;2013年03期

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2 范作晓;棉纤维发育过程中的细胞程序性死亡及植物生长调节剂调控的研究[D];山东农业大学;2007年

3 辛婧;海岛棉纤维发育相关转录因子GbSBP8的克隆及表达研究[D];上海交通大学;2007年

本文编号：2856634