百合单萜合成酶基因多态性研究和功能验证

发布时间：2020-10-27 18:19

　　百合的花香层次丰富,不同的类群花香不同。大部分亚洲百合没有香味;而东方百合香味过于浓烈,很多消费者并不喜欢。所以增加亚洲百合的香味,降低东方百合的香味是百合育种家试图实现的目标。东方百合中致香的关键成分是单萜类物质,所以对百合花香基因的研究主要集中在单萜合成酶基因。单萜类物质成分和含量随品种不同而不同,为了研究单萜合成酶基因在不同品种百合中的多态性,本试验在66个百合品种中克隆百合单萜合成酶基因,一共获得32个单萜合成酶基因,这些基因可以分为三类:LTPS-a、LTPS-b 和 LTPS-c,在 32 个基因中有 23 个属于 LTPS-a,2 个属于 LTPS-b,7个属于LTPS-c。其中有71.01%的品种中都含有LTPS-a,它的开放阅读框有1761bp,编码586个氨基酸·,克隆到的LTPS-b数量最少,只存在于8.70%的品种中,有12个碱基的插入,它的开放阅读框有1773bp,编码590个氨基酸;有36.23%的品种中都含有LTPS-c,它缺失114个碱基,开放阅读框有1647bp,编码548个氨基酸。三类单萜合成酶都存在萜类合酶保守域DDxxD和单萜类合酶保守域RRx8W。LTPS-a和LTPS-b存在底物结合保守域RX8H,但LTPS-c不存在此保守域。三类单萜合成合酶中分别有55、8、39个SNPs,LTPS-a的核酸多态性指数最大。研究基因多态性与单萜类物质释放量的关系发现,第230,873位点的突变和α-蒎烯的释放量相关性最大,而第99,101,407,1108,1150,1225位点的突变和罗勒烯的释放量相关性最大。从有香百合O1 1中克隆到三种单萜合成酶基因:LsoTPS-α、LsoTPS-b和LsoTPS-c,无香百合AT6中克隆到两种单萜合成酶:LrlTPS-a和LrlTPS-c,构建这五个基因的超表达载体,转化到大肠杆菌中进行表达,诱导后上述五个基因在大肠杆菌中均有表达,但亚洲百合中的LrlTPS-c表达量较低,通过超声波破碎法提取蛋白用于体外酶活性分析,在蛋白中加入单萜合成酶的底物香叶基焦磷酸(GPP),5个基因均可把GPP转化为罗勒烯。
【学位单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S682.29
【部分图文】：

电泳图,电泳图,合成酶基因

２．２．１总ＲＮＡ的提取??利用Ｔｎｚｏｌ裂解液提取６６个百合品种盛丌期花瓣的总ＲＮＡ，取４卟进行琼脂糖??凝胶电泳以检测其质量，通过生物光度ｉｌ检测总含鼠和质■＾图２显示Ａ３、Ａ５、Ａ６??和Ａ７的ＲＮＡ电泳图，表明提取的ＲＮＡ既无降解、也尤污染。??气争ｉ?ｉ?丨??、养一雙，善要－．辱?１０００???ｓｅｃ??．＇ｔ??图２?Ａ３、?Ａ５、?Ａ６?＃卩Ａ７总ＲＮＡ电泳图??Ｆｉｇ．?２?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｐａｔｔｅｒｎ?ｏｆ?ＲＮＡｓ?ｉｎ?Ａ３，?Ａ５，?Ａ６?ａｎｄ?Ａ７??２．２．２单萜合成酶基因序列分析??以反转录得到的ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，在６６个品种中都得到一条１７００ｂｐ??左右的片段，将此片段进行克隆测序获得序列信息。６６个百合品种中一共得到３２个单??萜合成酶基因可分为三个类型，命名为ＬＴＰＳ－ａ、ＬＴＰＳ－ｂ、ＬＴＰＳ－ｃ（图３）。ＬＴＰＳ－ａ型序列??有２３个，ＬＴＰＳ－ｂ型序列有２个，ＬＴＰＳ－ｃ型序列有７个。这３２个基因可以翻译成２３??个蛋白

序列,合成酶基因,单萜,系统发育树

以反转录得到的ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，在６６个品种中都得到一条１７００ｂｐ??左右的片段，将此片段进行克隆测序获得序列信息。６６个百合品种中一共得到３２个单??萜合成酶基因可分为三个类型，命名为ＬＴＰＳ－ａ、ＬＴＰＳ－ｂ、ＬＴＰＳ－ｃ（图３）。ＬＴＰＳ－ａ型序列??有２３个，ＬＴＰＳ－ｂ型序列有２个，ＬＴＰＳ－ｃ型序列有７个。这３２个基因可以翻译成２３??个蛋白，ＬＴＰＳ－ａ型蛋白有１４个，ＬＴＰＳ－ｂ型蛋白有２个，ＬＴＰＳ－ｃ型蛋白有７个，将这??些基因序列提交ＮＣＢＩ，得到登录号（表５）。这三种ＬＴＰＳ基因在不同百合杂种系的??分布也不同，如表６所示，ＬＴＰＳ－ｂ在所有品种中的分布是最少的（占品种数的８．７０％），??只在六个品种中发现它，喇东百合、亚喇百合、麝东百合中均未克隆得到ＬＴＰＳ－ｂ；?ＬＴＰＳ－ａ??在所有品种中的分布是最广泛的，分布于７６．８１％的品种中；ＬＴＰＳ－ｃ的分布范围居中，??分布于２６．０９％的品种中。－些百合品种中同时克隆到２到３种单萜合成酶基因，例如：??Ａ３、Ａ８、ＡＴ６、Ｔｌ、０Ｔ１３?和?ＯＴ１６?都含有?ＬＴＰＳ－ａ?和?ＬＴＰＳ－ｃ。Ｎ１?含有?ＬＴＰＳ－ａ?和?ＬＴＰＳ－ｂ

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