二穗短柄草根中木栓质脂肪醇合成基因的克隆与功能验证

发布时间：2020-10-27 20:13

　　 植物根部木栓质在植物抵御各种生物和非生物胁迫中具有重要作用。二穗短柄草作为麦类作物重要的模式植物,研究其与抗旱相关基因和机理,可为小麦等重要作物的研究提供借鉴。本论文通过气相色谱质谱联用仪(GC-MS)和气相色谱(GC)分析了二穗短柄草根中木栓质的组成和含量及其变化特点。利用拟南芥木栓质脂肪醇合成酶基因AtFAR1的蛋白序列在二穗短柄草数据库中分别进行同源比对,对获得的同源序列进行生物信息学分析,确定出了二穗短柄草木栓质脂肪醇合成酶相关的候选基因;分析候选基因在不同组织的表达特征,从中选择重要的候选基因进行了克隆和功能验证。研究结果如下:1.二穗短柄草根中木栓质组成成分有初级脂肪醇、脂肪酸、ω-羟基脂肪酸和α,ω-二羧酸,物质组成与已经发表的拟南芥和其他物种的木栓质组成成分相似。但是在组成成分的含量上存在一定的差异。2.二穗短柄草基因组中存在6个候选基因,共编码6个蛋白质。氨基酸序列多重比对后显示,只有BdFAR4(Bradi3g20000)与AtFAR1具有50%以上的氨基酸一致性,BdFAR1(Bradi4g38460)、BdFAR2(Bradi3g42780)、BdFAR3(Bradi4g37860)、BdFAR4(Bradi3g20000)、BdFAR5(Bradi1g73877)和BdFAR6(Bradi4g37860)与AtFAR1的氨基酸序列一致性分别是40.34%、42.30%、45.20%、50.80%、35.61%和44%。通过生物信息学分析,推测这些基因可能具有合成初级脂肪醇的功能。前期我们已克隆了BdFAR1、BdFAR2和BdFAR3,并已证明BdFAR1、BdFAR2和BdFAR3参与二穗短柄草叶片表皮蜡质中脂肪醇的合成;而BdFAR4主要在根中表达。因此,我们推测BdFAR4可能参与二穗短柄草根中木栓质脂肪醇的合成。3.在酵母中异源表达BdFAR4基因表明,BdFAR4具有编码脂肪酰基辅酶A的功能。通过构建酵母表达载体,转化酵母与提取酵母产物检测后,我们发现相比于空载体,转化了目的基因的酵母菌株中合成了链长为C20和C22的脂肪醇。4.在番茄中异源表达BdFAR4基因表明,转基因番茄T_1代的根中木栓质脂肪醇的含量显著增加,其中以链长为C20和C22的初级脂肪醇增加最多。与空载体植株相比,转基因植株根中木栓质脂肪醇的含量明显增加了1.4-1.7倍,其中链长为C20的初级脂肪醇增加了1.3-1.8倍,链长为C22的初级脂肪醇增加了1.4-1.8倍。综上结果表明BdFAR4具有合成木栓质脂肪醇的功能,并且主要合成链长为C20和C22的初级脂肪醇。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q943.2
【部分图文】：

甲苯胺蓝、荧光黄 88、小蘖碱和苏丹红对含木栓质的组织染色，使用荧光显微镜可测到木栓质的脂类物质、酚类物质和其他组成木栓质的物质(Brundrett et al. 1988)。这些染色技术我们在植物的根部、周皮和块茎部位发现了木栓质，但是由于染色技够灵敏，在木栓质合成的早期以及植物生长的不同时期木栓质合成较少时会存在检到木栓质的情况。例如研究者对拟南芥发育后期的种子染色发现只在种子合点区域，利用荧光黄 88 染料或苏丹红 7B 对植物(Gyceria maxima)根进行染色也没有检测栓质的存在，但是对 Gyceria maxima 木栓质进行气相色谱质谱联用仪(GC-MS)分析，该植物的根部已经形成了较多的脂肪类物质，使用荧光显微镜观察该植物根的横发现酚类物质已经开始沉积(Schreibe, 2007; Beisson et al. 2007; Franke et al. 2009)。透射电子显微镜观察发现，木栓质的片层结构呈明暗相间的结构，并有研究者发现质的深色带层与酚类物质的含量有关，浅色带层的厚度与木栓质脂类物质中的脂肪烷基链长度相关(Buchala and Ryser; 1996; Bernards, 2002)。有研究发现在栓皮栎的根木栓化的过程中，木栓质最早出现在栓皮栎的内皮层凯氏带中(Machado et al.13)。植物细胞壁中木栓质的分布以及组成木栓质的化学物质会因为植物的发育阶及各组织的不同功能而有所差异。

图 1-2 木栓质合成及其运输至细胞壁的路径概述（韩雪源和茅林春，2017）Fig.1-2 Overview of the suberin biosynthetic pathway with subsequent transportto the cell wall组成木栓质的单体物质主要是超长链脂肪酸衍生物(C18-C30)、ω-羟基脂肪酸和α羧酸。因此，木栓质生物合成过程中两个重要的步骤是脂肪酸延长和ω-碳氧化。脂的合成发生在细胞质体内，主要由脂肪酸合成酶复合体(fatty acids synthmplex,FAS)催化合成的，脂肪酸的合成需经过缩合、还原、脱氢和还原四步反应。合反应：在β-酮酰-ACP 合成酶(β-ketoacyl-ACP synthases, KAS)的催化下，酰基-A来自 2C 供体的丙二酰-ACP(malonyl-ACP)发生反应，产生 4C 的中间产物β-酮酰-A)还原反应：在β-酮酰-ACP 还原酶(β-ketoacyl-ACP reductase, KAR)的作用下，将 4C酮酰-ACP 还原为 4C 的β-羟酰-ACP。(3)脱氢反应：4C 的β-羟酰-ACP 在β-羟酰-A水酶(β-hydroxyacyl-ACP dehydrase, DH)的催化下脱掉一个水分子形成 4C 的反式-酰 ACP。(4)还原反应：在反式-△2-烯酰 ACP 还原酶（trans-△2-enoyl-ACP reductR）作用下，将 4C 的反式-△2-烯酰 ACP 还原为 4C 的酰基-ACP。这样每经过一个，就多增加 2 个碳原子，大概经过 6~7 次循环后，就形成了 C16或 C18的酰基-AC

第三章 二穗短柄草木栓质脂肪醇合成酶基因 BdFAR4 的克隆 白质序列，利用 MEGA 6.06 软件与来自普通小麦和拟南芥树分析。如图 3-2 所示，这些同源蛋白序列可以分为两大类白，一类是小麦中的同源蛋白，而二穗短柄草中的 BdFAAR4、BdFAR5 和 BdFAR6 与拟南芥和小麦中的同源基因聚合小麦中的FAR基因聚在一支可能的原因是二穗短柄草和小麦同源关系较近。由此推测候选基因 BdFAR1、BdFAR2、BdFFAR6 可能具有合成初级脂肪醇的功能，可能参与植物根中
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 韩雪源;茅林春;;木栓质组成成分、组织化学特性及其生物合成研究进展[J];植物学报;2017年03期

相关硕士学位论文 前1条

1 孙瑜琳;小麦叶片和穗表皮蜡质组分分析及其相关合成基因的筛选[D];西北农林科技大学;2015年

本文编号：2859001