异育银鲫免疫基因的克隆及表达分析和重组IFNc蛋白抗Ⅱ型鲤疱疹病毒的免疫保护研究

发布时间：2020-10-30 09:39

　　 异育银鲫(Carassius auratus gibelio)是亚洲最受欢迎的食用鱼类,鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)是唯一已知的鲫鱼病毒病原体。I型干扰素基因在病毒核酸被宿主细胞识别时诱导,被公认为在提供针对各种生物体中的病毒的局部或全身保护中的发挥重要作用。在转录组分析中发现部分异育银鲫基因响应CyHV-2感染的差异表达,部分干扰素转录物在被感染的异育银鲫肾中显著上调,该干扰素在本实验中被命名为异育银鲫IFNc(ccIFNc)。IκBα(Inhibitor of NF-κB),Rab21(Rab GTPase21)在先天免疫中起重要作用,它们被抑制消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)证实为感染鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)的异育银鲫中差异表达的免疫相关基因。通过RACE技术进一步确定了异育银鲫IFNc,IκBα,Rab21的完整ORF,IFNc的全长cDNA包含一个549 bp的开放阅读框(ORF),编码182个氨基酸的蛋白(GenBank登录号BankIt2033924),异育银鲫IκBα的全长cDNA包含一个933bp的开放阅读框(ORF),编码310个氨基酸的蛋白(GenBank登录号KJ784543),Rab21的全长cDNA包含一个648 bp的开放阅读框(ORF),编码215个氨基酸的蛋白(GenBank登录号KJ784545)。系统发育分析表明,ccIFNc与来自其他水生生物的已知I型IFN基因聚类,IκBα,Rab21显示出与其他硬骨鱼中的转录物高度同源。定量RT-PCR分析表明,健康异育银鲫中,IκBα,Rab21在所检测的所有鲫鱼组织中均以低水平表达,这些基因在CyHV-2感染后6-24小时在肾中显著上调(P0.01),数据表明IκBa,Rab21可能有潜在的抗病毒功能,IκBα和Rab21可作为宿主对CyHV-2感染免疫反应的免疫标记。健康异育银鲫中,ccIFNc在脾,鳃,肾和肌肉中具有相对较高的表达水平。在CyHV-2的攻击下,ccIFNc的转录水平在所有组织中都有明显上调,尤其是在脾和鳃中,分别增加了436和158倍。肌肉(i.m.)注射编码ccIFNc的真核表达质粒(pEGFP-cIFNc)观察到ccIFNc表达明显增加高于对照细胞15倍,CyHV-2的复制效率显着低于对照组,过表达IFNc的异育银鲫总体死亡率降低了30%,死亡时间有所延迟,本文研究表明,ccIFNc属于I型干扰素家族,在对抗鲫鱼CyHV-2感染方面具有潜在的作用。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S943
【部分图文】：

图 2-1 基因全长 cDNA 扩增线路图Fig2-1具体操作如下：总 RNA 提取后，按照试剂盒的说明合成 cDNA 第一条链(1) 在 0.5ml 微型离心管中加入下列试剂：(2) 在分别取两个离心管加入如下试剂

图 2-2 Rab21 的全长核苷酸序列Fig. 2-2 Full-length nucleotide sequence of Rab21DNAMAN 软件来自不同生物体的 Rab21 氨基酸序列进行多。Rab21 通过 NJ 方法得到的所有可用的动物序列的进化树 MEGA5 程序进行。Rab21 的进化树分析表明其有两个集 。异育银鲫的 Rab21 属于集群 I, 包括背天使（Pundamilia（Neolamprologus brichardi），斑马宫丽鱼（Maylandia z（Haplochromis burtoni）。异育银鲫的 Rab21 和斑马鱼很

17图 2-3 Rab21 的多序列比对(A)，3D 蛋白结构(B)和系统发育树分析(C)Fig.2-3 multiple sequence alignments(A) ,3D protein structureand (B)phylogenetic tree analysis ofccIFNc(C).2.2.2 IκBα 的全长及序列分析特定的免疫相关基因的引物设计和通过 RACE-PCR 获得 5’和 3’cDNA 全长，该基因(GenBank accession no.244 KJ784543)全长 1,388 bp.由一个 40bp 的 5’非编码区，933bp 的开放阅读框，和一个包含 polyA 的 413bp 的 3’非编码区，IκBα 开放阅读框编码多肽含有 310 个氨基酸(aa)。高度保守的特征域被确定,IκBα 基因具有对 NF-kb 信号通路多种抑制功能，包括利用封闭核酸的迁移，DNA 的结合以及利用蛋白酶 A 磷酸化 NF-kb 蛋白。鲫鱼 IκBα 基因分子水平的
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本文编号：2862297