巴哈雀稗DREB2基因克隆与表达分析

发布时间：2020-11-02 07:36

　　 干旱和盐碱胁迫严重影响植物的生长发育。在高等植物长期进化过程中,已经形成了各种复杂的防御机制抵抗逆境,其中DREB类转录因子是植物中所特有的一类能与DRE顺式作用元件特异性结合的转录因子。在非生物逆境胁迫中这类转录因子可调节下游一系列抗逆基因的表达。因此,利用DREB转录因子来改良作物的抗逆性在植物遗传育种中能获得较为理想的综合效果。巴哈雀稗(Paspalum notatum)作为一种推广应用较为广泛的牧草,本身具有较强的抗逆特性,可作为研究植物抗逆机理的好材料。为挖掘巴哈雀稗抗逆基因,初步揭示其抗逆机理,本研究在克隆巴哈雀稗DREB2基因的基础上,采用PEG-6000(20%)和Na Cl(300 mmol·L-1)溶液处理模拟逆境胁迫,分析该基因的时序表达和生理指标变化情况。研究结果如下:(1)巴哈雀稗经转录组测序共获得了42,844,132个序列读取片段(reads),包含了6,426,619,800 bp(6.42 GB)的序列信息。对reads进行序列组装,获得99,235个单基因簇(unigene),平均长度641.96 bp。(2)巴哈雀稗53,886个unigene在NR数据库中可找到相似序列,相似序列匹配的近缘物种中,与谷子(Setaria italica)、高粱(Sorghum bicolor)和玉米(Zea mays)匹配度最高。经GO、COG和KEGG功能分类注释分析,均指出其大量unigene与信息传导机制、运输及代谢相关。(3)采用RNA-Seq结合RT-PCR技术从巴哈雀稗中获得一个DREB2基因,命名为Pn DREB2(Gen Bank登录号:MH150946)。氨基酸序列分析表明,该基因开放阅读框全长774 bp,可编码257个氨基酸,相对分子量为28.09 k D,理论等电点为5.25。Pn DREB2蛋白含有DREB类基因家族典型的保守域——AP2结构域。(4)进化和聚类分析结果表明,巴哈雀稗DREB2基因与高粱、割手密(Saccharum spontaneum)、玉米、谷子及牛鞭草(Hemarthria compressa)亲缘关系较近,氨基酸序列同源性分别为91.10%、89.50%、88.20%、87.60%和87.60%。(5)实时定量PCR分析表明,旱、盐胁迫下Pn DREB2基因在巴哈雀稗茎中表达量最高,幼穗次之,叶最低;Pn DREB2 m RNA表达强烈,受干旱(PEG-6000,20%)胁迫诱导,同时也受到高盐(Na Cl,300 mmol·L-1)胁迫诱导,随胁迫时间的延长总体呈现出先升高后降低的趋势。(6)随着PEG胁迫时间的延长,可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、POD活性、SOD活性、叶绿素a含量均表现为先增后降趋势,CAT活性则呈现先降后增趋势;叶绿素b与总叶绿素含量呈先升后降再小幅度上升趋势;脯氨酸和丙二醛随胁迫时间延长含量增加。(7)随着Na Cl胁迫时间的延长,可溶性蛋白含量表现为逐渐下降趋势;脯氨酸和丙二醛含量均随着Na Cl胁迫时间的延长而增加;其余指标均呈先增后降的变化趋势。(8)在Na Cl和PEG两种胁迫下,DREB2基因相对表达量均表现出与抗氧化酶类呈显著正相关关系,与总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b呈负相关关系。而DREB2基因相对表达量与可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸、丙二醛之间在两种胁迫处理下存在差异:盐胁迫下,DREB2基因表达量与可溶性糖、可溶性蛋白呈不显著正相关,与脯氨酸、丙二醛呈负相关;干旱胁迫下,DREB2基因表达量与可溶性糖、脯氨酸呈显著正相关,与丙二醛不显著相关,与可溶性蛋白呈负相关。
【学位单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S543.9
【部分图文】：

贵州大学 2018 届硕士学位论文的序列信息（图 2.1）。采用 Trimmomatic 进行数据处理，获得 40,006,430 Cleareads。进一步对序列进行组装，获得 99,235 个 unigene，长度大于 500bp 的 unigen有 37,413 个，长度大于 1,000bp 的 unigene 有 18591 个，其中，最长的 unigen长度为 10 795bp，最低的 unigene 长度 201 bp，平均长度为 641.96 bp。

后依次是高粱（19.66%）、玉米（Zea mays, 12.82%）、二穗短柄草（Brachypodiumdistachyon, 6.62%）、大麦（Hordeum vulgare, 6.31%）、节节麦（Aegilops tauschii,4.39%）、水稻（Oryza sativa, 3.55%）等（图2.2），由于缺乏巴哈雀稗的基因组、EST和蛋白序列信息，部分的unigene在数据库中无法与已知基因进行匹配。

图 2.3 巴哈雀稗 unigene 的 GO 注释分类柱状图Figure 2.3 Paspalum notatum GO annotation unigene's classification histogram注：横轴为 GO 的二级分类，纵轴为该分类内基因个数（右）及其占被注释上基因总数的百分比（左）。Note: The horizontal axis is the secondary classification of GO, and the vertical axis is the number of genes in theclassification (right) and the percentage of the total number of genes being annotated (left).2.5.4 巴哈雀稗unigene的COG功能分类注释将巴哈雀稗unigene与COG数据库进行比对分析，并预测其功能，然后进行分类统计。结果表明，根据巴哈雀稗unigene功能，大致可分为25类（图2.4中用A～Z表示），然后对每一类的unigene进行详细的分析，得知unigene包含了大多数的生命活动，涉及的COG功能类别比较全面。其中，信息传导机制类基因最多（3,330个）；其次是翻译后修饰，折叠和分子伴侣类基因（3,105个）、一般功能预测类基因（2,924个）和翻译，核糖体结构和生物发生类基因（2,053个）；而胞外结构类基因（77个）和核结构类基因较少（103个），细胞运动类基因最少（9个）。
【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 宋华伟;张巨明;刘颖;姬静华;;镧浸种对百喜草种子萌发及生理生化特性的影响[J];北方园艺;2015年20期

2 刘超;马丽;李月;代培红;姚正培;张桦;;梭梭中HaDREB2A的克隆与表达分析[J];基因组学与应用生物学;2015年09期

3 郑晟;陈静;吴邦志;陈璋;;百喜草对人工土壤活性养分浓度的生理生态响应[J];北方园艺;2015年14期

4 李章磊;高飞;曹玉震;张至玮;王宁;李华云;周宜君;;蒙古沙冬青AmDREB2.1基因的克隆及表达分析[J];生物技术通报;2015年03期

5 魏晓玲;程龙军;窦锦青;徐凤华;;巨桉EgrDREB2A基因结构及表达特性分析[J];林业科学;2015年02期

6 郭婷;王茅雁;董博;姜晓旭;武雅琪;;蒙古沙冬青AmDREB2C基因的克隆及表达分析[J];植物遗传资源学报;2015年02期

7 代英超;徐奎源;马凯;张云;夏国华;李根有;;珍稀濒危植物堇叶紫金牛对持续干旱的生理响应[J];生态学报;2015年09期

8 张志飞;杨知建;周倩;赵志丽;;DREB2s转录因子基因的表达调控机制研究进展[J];植物科学学报;2014年03期

9 李雁博;张蕴薇;哈依夏;杜金鸿;刘源;陈果;王佺珍;;须芒草、虉草和柳枝稷对干旱和盐胁迫的生理响应[J];草业科学;2014年05期

10 张怀山;赵桂琴;栗孟飞;夏曾润;王春梅;;中型狼尾草幼苗对PEG、低温和盐胁迫的生理应答[J];草业学报;2014年02期

相关博士学位论文 前5条

1 廖雄;新疆野苹果MsDREB6.2转录因子在干旱应答中的作用机理研究[D];中国农业大学;2016年

2 赵清;拟南芥chyB和DREB2A基因对转基因烟草抗逆的研究[D];天津大学;2013年

3 TCHOUOPOU LONTCHI Josine（思妮）;耐盐月季的选育及表达拟南芥AtDREB2A-CA对月季耐盐性的研究[D];天津大学;2012年

4 吴杨;斑茅DREB2B基因遗传转化甘蔗的抗旱性研究[D];福建农林大学;2009年

5 田秀红;水稻DREB转录因子基因的克隆及相关研究[D];中国农业大学;2004年

相关硕士学位论文 前10条

1 蒋洪涛;转Ea-DREB2B基因甘蔗苗期抗旱性及相关基因表达分析[D];广西大学;2016年

2 马丽;梭梭再生体系研究及HaDREB2C基因的克隆与分析[D];新疆农业大学;2016年

3 禹梅;香蕉成熟相关转录因子MaDREB2互作蛋白的筛选与鉴定[D];华南农业大学;2016年

4 高刚;赖草属植物DREB2转录因子的克隆及特性分析[D];四川农业大学;2012年

5 王晓静;DREB2E参与拟南芥对于多种非生物胁迫的适应[D];河南大学;2012年

6 潘丽;小麦DREB2转录因子的自然等位变异的发掘[D];电子科技大学;2010年

7 王晓飞;大豆转录因子GmDREB的功能分析[D];中国农业科学院;2008年

8 高峰;水稻AP2/EREBP类转录因子基因的功能研究[D];扬州大学;2007年

9 盛慧;DREB2A、SCMRP基因双价植物表达载体的构建及对苜蓿的遗传转化[D];东北农业大学;2006年

10 王平荣;水稻DREB转录因子基因的克隆及干旱对稻米品质的影响研究[D];四川农业大学;2005年

本文编号：2866756