NAT2基因多态性与AML遗传易感性研究和NPC1与经典wnt信号通路的相互作用

发布时间：2020-11-09 01:08

　　 第一部分NAT2基因多态性与AML遗传易感性研究背景:急性髓系白血病(acutemyelocytic leukemia,AML)是成年人中最好发的一类白血病,也是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病。随着研究的广泛开展和深入进行,我们对于AML的发病机制有了越来越多的了解和认识。遗传-环境模式依然是当前对于AML发病原因最主流的认识。在遗传因素的研究中,一些重要基因突变与AML发病之间的关联性被不断揭示。2型N-乙酰转移酶(N-acetyltransferase2,NAT2)是乙酰转移酶家族中的一员,在人体对于外来性化合物的代谢过程中发挥着重要的作用。研究发现在编码NAT2的基因上存在着较多的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs)。进一步的研究显示,某些可以影响NAT2催化效率的SNPs与多种肿瘤的遗传易感性相关,rs1799930(G590A)和rs1799931 (G857A)就是其中比较突出的两个。近年国外进行的一些研究显示,这两个SNPs与白血病的发病风险存在着相关性,但是在我国人群,尤其是汉族人群中是否具有这种相关性还没有报道。因此,我们进行了这项病例对照研究来探讨在我国汉族人群中NAT2的这两个SNPs与AML的发病风险是否具有明确的相关性。方法与结果:1、我们收集了 98例我院初诊的AML患者和112例健康体检者的外周血标本,在提取全血DNA后,再通过PCR扩增,最后通过对PCR产物测序得到了病例组和对照组在rs1799930和rs1799931这两个SNPs位点的基因型数据。病例组中rs1799930位点共有基因型GG 59例、GA 31例、AA 8例,rs1799931位点共有基因型GG 68例、GA28例、AA 2例;对照组中rs1799930位点共有基因型GG 61例、GA 46例、AA 5例,rs1799931位点共有基因型GG61例、GA46例、AA5例。2、我们通过数据分析软件对SNPs数据进行进一步的分析。通过卡方检验,确定了病例组和对照组均满足哈迪温伯格平衡定律(P0.05)。进一步的分析显示,NAT2基因的rs1799930 SNPs与AML的发病风险没有显著相关性(P0.05); NAT2基因的rs1799931 SNPs与AML的发病风险密切相关,rs1799931的突变等位基因A是AML发病的一个保护因素(OR=0.585, 95%CI=0.361-0.950),杂合子GA基因的携带者比祖先基因型GG的发病风险要低(OR=0.546, 95%CI=0.305-0.978)。结论:在我国汉族人群中,NAT2基因的rs1799930 SNPs与AML的发病风险没有显著相关性,rs1799931 SNPs与AML的发病风险密切相关。rs1799931的突变等位基因A是AML发病的一个保护因素,杂合子GA基因的携带者比祖先基因型GG的发病风险要低。第二部分NPC1与经典wnt信号通路的相互作用及机制研究背景:Wnt信号通路是调控多细胞生物生长发育以及维持机体内稳态的一条重要信号通路。经典的wnt/β-catenin信号通路是目前wnt信号通路中研究最广泛也最透彻的一条信号。经典Wnt信号通路的异常与肿瘤、退行性疾病等多种疾病的发生密切相关。诸多的研究已经证明,经典wnt信号通路与正常和异常的造血均有紧密的联系。通过靶向抑制经典wnt信号通路已经成为了包括治疗白血病在内的多种肿瘤的一个研究热点。C型1类尼曼匹克蛋白(Niemann-Pick disease type C1 ,NPC1)是存在于溶酶体/晚期内体膜上的一个重要蛋白,与细胞内游离胆固醇和某些鞘磷脂等脂质的转运紧密相关。NPC1或者NPC2基因的突变可以导致C型尼曼匹克病的发生。先前的研究显示,NPC1突变的细胞内存在着多个信号通路的异常,wnt信号通路也有可能置身其中。还有研究显示,经典wnt信号通路可以调控细胞内胆固醇的代谢,作为胆固醇转运环节中必不可少的重要蛋白,NPC1也有可能受到经典wnt信号通路的调节。但是目前还没有关于NPC1与经典wnt信号通路之间相互作用的确切报道。因此,我们进行了本项研究来探究NPC1与经典wnt信号通路之间的确切作用关系和相关机制。方法与结果:1、我们在常见的几个细胞系中使用慢病毒的方法,构建了 NPC1稳定敲低的细胞系。通过蛋白印迹(westernblotting,WB)检测了细胞内β-catenin蛋白表达量的变化。接着我们通过WB技术和免疫荧光技术(immunofluorescent staining,IF)检测了β-catenin蛋白在细胞内的分布。我们还使用了定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,QPCR)技术和Top-Flash报告基因技术检测了经典wnt信号通路下游靶基因的转录水平变化,明确wnt信号通路活性的变化。最后我们通过在NPC1敲低细胞系中过表达NPC1,检测β-catenin蛋白量的变化,确定是否能够回救NPC1敲低对经典wnt信号通路的抑制作用。结果显示,NPC1敲低或者功能受抑后细胞内β-catenin蛋白的总量减少,细胞核内的β-catenin减少,wnt信号通路下游靶基因转录水平下降,过表达NPC1后,NPC1敲低细胞中下调的β-catenin蛋白恢复正常水平。2、我们通过使用放线菌酮(cycloheximide,CHX)阻断细胞内β-catenin合成之后,使用WB技术检测不同组细胞内β-catenin随时间的变化。通过免疫沉淀技术(immunoprecipitation,IP)和WB,检测不同组细胞内β-catenin的泛素化水平差异。结果显示,NPC1敲低或者功能受抑后,细胞内β-catenin蛋白的下降速率更快、泛素化水平更高。3、我们通过慢病毒技术构建了 β-catenin稳定敲低的细胞系,通过WB检测细胞内NPC1表达的变化,使用QPCR检测了NPC1转录水平的变化。我们还使用了 wnt信号通路的激动剂和抑制剂来干预wnt信号通路活性,WB检测细胞内NPC1表达水平的变化。结果显示敲低β-catenin或者使用经典wnt信号通路抑制剂之后NPC1的表达水平降低。过表达β-catenin或者使用经典wnt信号通路的激动剂可以上调NPC1的表达。4、我们在K562细胞系中通过敲低NPC1以及使用NPC1的抑制剂后,使用细胞增殖检测试剂盒来检测细胞增殖受到的影响。结果显示,在敲低NPC1或者使用NPC1抑制剂之后,细胞的增殖显著受抑。在K562耐药细胞细胞株中联合使用NPC1抑制剂和伊马替尼之后,细胞增殖相比单独使用伊马替尼的细胞明显受抑。结论:NPC1可以通过影响β-catenin的磷酸化-泛素化-蛋白酶体降解,调控经典wnt信号通路的活性。经典wnt信号通路也可以调控NPC1的表达。NPC1与经典wnt信号通路之间存在相互调节的关系。我们可以通过使用NPC1的抑制剂来抑制经典wnt信号通路的活性,从而使白血病细胞(至少依赖于经典wnt信号通路的白血病细胞)生长受抑,甚至使因为经典wnt信号通路过度活化导致耐药的白血病细胞重新获敏。
【学位单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R733.71
【部分图文】：

带有shRNA插入序

?Ｉ??图２?ＱＰＣＲ反应的程序设置??两步法ＰＣＲ扩增标准程序（图２）：??第一步：预变性，??９５°Ｃ，３０?秒。??第二步：ＰＣＲ反应，??９５°Ｃ?５秒，６０°Ｃ?３０－６０秒，如此循环４０次。??第三步：分罔。??（５）实验结果分析??１）

４．３．２ＮＰＣ１的功能被抑制剂抑制之后，细胞内的ｐ－ｃａｔｅｕｉｎ总量减少??Ｕ１８６６６Ａ?（本文中亦简称作ＵＡ），可以抑制ＮＰＣ１的功能，研宄中常用它来模拟??敲低ＮＰＣ１的状态，被认为是ＮＰＣ１的经典抑制剂。文献中几乎还没有用ＵＡ来处理??Ｈｅｌａ细胞的报道。经过我们的摸索，发现在Ｈｅｌａ细胞中，当ＵＡ的浓度大于等于２Ｕｇ／ｍｌ??的时候，细胞内的Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ总量会有比较明显的下降。对于ＵＡ，这样的使用浓度与??文献报道中其他细胞的常用浓度处于ｕｇ／ｍｌ这同一量级。ＵＡ对细胞内Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ总量??的抑制作用呈现出浓度依赖的关系（图４）。但是ＵＡ的浓度也不是可以无限制的增加，??一方面受限于在溶剂中的溶解性，当浓度过大时，有细胞毒性的溶剂（ＤＭＳＯ）将会??严重影响细胞状态；另一方面，ＵＡ自身也存在着较大的细胞毒性，浓度过大时将导??致细胞阔亡。??Ｈｅｌａ??ＵＡ?（ｕｇ／ｍｌ），?１?２ｈ?０?２?３?４?５??
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 Roel NUSSE;Wnt signaling in disease and in development[J];Cell Research;2005年01期

本文编号：2875643