雪峰虫草子座人工培养及其交配型基因的研究

发布时间：2020-11-09 06:50

　　 虫草是寄生于昆虫、植物和少数真菌的一类真菌的总称,是真菌遗传学研究的好材料,其中许多种类属于名贵药材。雪峰虫草(Ophiocordyceps xuefengensis)为近年来发现的真菌新物种,它寄生于活体植物大青的根或者茎中的疖蝙蛾幼虫体上,仅在湖南雪峰山区有发现,是已知的最大的虫草,被证实是与冬虫夏草(O.sinensis)亲缘关系最近的物种。本论文对雪峰虫草无性型的生物学特性、人工培养条件、有效成分和交配型基因进行了研究。(1)从野生雪峰虫草子座中分离获得菌株,从分离菌的培养特性、形态特征、分子水平(ITS区序列)等方面展开研究,并对分离菌进行人工培育,获得了雪峰虫草的子座,从而确定了雪峰虫草的无性型;交配型基因的分布检测结果表明:只有子囊含有两种交配型基因,证明雪峰虫草属于异宗配合真菌。(2)以雪峰虫草菌作为出发菌株,在单因素实验的基础上,采用PB实验设计、最陡爬坡实验和中心组合实验优化发酵条件,并通过建立多项式数学模型,采用统计分析对模型进行显著性检验拟合出最佳发酵条件。在优化的条件下,发酵液中菌丝的生物量可达18.8 g/L,相比单因素实验最适条件下菌丝的生物量16 g/L,提高了 17.5%。通过L9(34)正交试验确定了雪峰虫草子座的最佳培养条件为:固体基质20 g、固体基质与子实体培养液比为1:2(W/V)、接种量为3%、22℃培养15 d(黑暗条件下),将组培瓶置于光照强度为20～40 Lux,温度为19℃,培养60 d后,子座干重达4.78 g,转化率可达22%。这为进一步研究雪峰虫草的活性物质打下了坚实的基础。(3)对雪峰虫草不同组织的主要活性成分进行了分析。采用高效液相色谱法(HPLC)系统分析了雪峰虫草不同组织中9种主要核苷类成分的含量,结果表明野生子实体中含腺苷最高(761.5 mg/kg),其次是人工培育的子座(721.2 mg/kg)和发酵菌丝体(623.9 mg/kg);发酵菌丝体中尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷和鸟苷的含量显着高于野生雪峰虫草样品;人工培育雪峰虫草中鸟苷的浓度也高于野生样品。人工培育的子座中腺苷的含量达到0.06%以上,远高于中国药典(2015版)规定天然虫草中腺苷的含量(0.01%)。雪峰虫草的3种不同组织(菌核、子座和菌丝体)中虫草酸含量分别为7.8%、11.7%和15.0%;其不饱和脂肪酸的相对含量分别是77.6%、66.1%和65.4%,菌核中的脂肪酸主要为油酸(单不饱和脂肪酸),人工子座和发酵菌丝体中脂肪酸主要为亚油酸(多不饱和脂肪酸)。3种不同组织中氨基酸含量分别为211.55 mg/g、191.48 mg/g和282.26 mg/g;人体必需8种氨基酸含量分别为104.93 mg/g、60.79mg/g和108.49mg/g。从核苷、虫草酸、脂肪酸和氨基酸水平来分析,雪峰虫草的发酵菌丝体和人工培育的子座可作为野生雪峰虫草的代品。(4)对雪峰虫草交配型MAT1-1和MAT1-2基因座进行了克隆与分析。利用hiTAIL-PCR技术克隆了雪峰虫草交配型MAT1-1和MAT1-2基因位点全长序列,并通过Southern印迹杂交技术对hiTAIL-PCR克隆的交配型MAT1-1和MAT1-2基因位点中的基因进行检测和验证。结果表明:①雪峰虫草与已报道的冬虫夏草的交配型基因MAT1-1位点和MAT1-2位点内基因的构成方式相同。②雪峰虫草的MAT1-2位点上含有单个基因MAT1-2-1,且为单拷贝基因。③MAT1-1位点包含MAT1-1-3、MAT1-1-2和MAT1-1-1三个基因,且极可能为单拷贝位点。④交配型MAT1-1和MAT1-2位点的左侧共有序列上含有DNA lyase基因。⑤雪峰虫草MAT1-1-3基因编码区长728 bp,含3个内含子,编码的多肽为192个氨基酸。MAT1-1-2基因编码区长1318bp,含3个内含子,编码的多肽为382个氨基酸;MAT1-1-1基因编码区长1220 bp,含2个内含子,编码的多肽为371个氨基酸。MAT1-2位点仅包含MAT1-2-1基因,其编码区长855bp,有2个内含子,编码249个氨基酸。雪峰虫草交配型基因座中MAT1-1-3、M4T1-1-2、MAT1-1-1和MAT1-2-1编码的氨基酸序列与冬虫夏草的相应氨基酸序列相似性分别为89%、88%、84%和90%,是目前已知的与冬虫夏草在DNA水平上相似性最高的物种。本研究为雪峰虫草的人工培养提供了理论指导;雪峰虫草的交配型体系为研究有性繁殖和性别选择提供了新的模型,为更好地了解真菌的遗传提供了线索。
【学位单位】：湖南师范大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q949.32
【部分图文】：

２－１、Ａ：雪峰虫草；Ｂ－Ｅ：分离菌株在ＰＤＡ上的菌落形态（Ｂ，３ｄ；?Ｃ，１０ｄ；?Ｄ，１５ｄ；?Ｅ，４５ｄ）??Ｆ：分离菌株的“Ｈ”型菌丝结合（４０〇ｘ）；?Ｇ：分离菌株的菌丝和分生孢子（４０〇ｘ）；标尺＝１〇叫１??Ｆｉｇ．?２－１?Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，?ｃｏｌｏｎｉｅｓ?ａｎｄ?ｃｏｎｉｄｉｏｓｐｏｒｅｓ?ｏｆ?Ｏｐｈｉｏｃｏｒｄｙｃｅｐｓ?ｘｕｅｆｅｎｇｅｎｓｉｓ??Ａ：?Ｏｐｈｉｏｃｏｒｄｙｃｅｐｓ?ｘｕｅｆｅｎｇｅｎｓｉｓ＼?Ｂ－?Ｅ?Ｃｏｌｏｎｙ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｓｔｒａｉｎ?ｏｎ?ＰＡＤ?ｍｅｄｉｕｍ?（Ｂ，?３ｄ；?Ｃ，?ｌＯｄ；?Ｄ，?１５ｄ；?Ｅ，??４５ｄ）?Ｆ：?Ｈｙｐｈａｌ?ｆｕｓｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｓｔｒａｉｎ；?Ｇ：?Ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ?ｏｆ?ｍｙｃｅｌｉｕｍ?ａｎｄ?ｃｏｎｉｄｉｏｓｐｏｒｅｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｓｔｒａｉｎ?（４００?ｘ）；??Ｂａｒｓ＝１０｝ｉｍ??分离的雪峰虫草菌株在改良的ＰＤＡ固体培养基上生长缓慢，２５°Ｃ下培养４５?ｄ菌落??直径为４．７？５．３?ｃｍ。菌落圆形，粉末样，致密，２５°Ｃ下培养３ｄ左右即在组织块上长出??白色的菌丝（图２－１Ｂ），?５ｄ后菌丝体延伸到固体培养基表面；１０ｄ后菌落直径达到１．６??

?１??０．０２??图２－２?ＮＪ法构建的基于ＩＴＳ序列的雪峰虫草和其它线虫草的系统发育树??Ｆｉｇ．?２－２?Ｔｈｅ?ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ?ｏｆ?Ｏｐｈｉｏｃｏｒｄｙｃｅｐｓ?ｘｕｅｆｅｎｇｅｎｓｉｓ?ａｎｄ?ｏｔｈｅｒ?Ｏｐｈｉｏｃｏｒｄｙｃｅｐｓ?ｓｐ．??ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ?ｂｙ?ｕｓｉｎｇ?ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ?（ＮＪ）?ｍｅｔｈｏｄ?ｂａｓｅｄ?ｏｎ?ｔｈｅ?ＩＴＳ?ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ??２．?３．?１．?３交配型基因在雪峰虫草中的分布??雪峰虫草是近年来新发现的真菌物种，同属不同种的交配型基因的序列相似性较??低，其完整序列的扩增相对较复杂，目前常通过ＰＣＲ技术扩增Ｍ４７７－ｉ－７基因中的高保??守ａ－ｂｏｘ片段和Ｍ４７７－２－７基因中的高保守ＨＭＧ－ｂｏｘ片段，以此来快速鉴别虫草的??型和从４７７－２型［８２，９８］。交配型检测结果如图２－３所示，结果表明：特异性引物??ＭＡＴ１－１Ｆ１／ＭＡＴ１－１Ｒ２?和?ＭＡＴ１－２Ｆ１／ＭＡＴ１－２Ｒ２?分别从野生的雪峰虫草（ＭＨＨＮＵ８７２８、??ＭＨＨＮＵ８９９１、ＭＨＨＮＵ８９９２和ＭＨＨＮＵ８９９３）成熟子囊的基因组ＤＮＡ中扩增出约??为２００?ｂｐ和３４０?ｂｐ的特异性条带

ｖ??Ａ??图２－４交配型基因在成熟的雪峰虫草中的分布示意图（该图由田径根据模式标本手绘??Ａ：成熟的雪峰虫草；Ｂ：子座上的有性子囊；Ｃ：子囊结构??Ｆｉｇ．?２－４?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｍａｔｉｎｇ?ｇｅｎｅ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ｉｎ?ｍａｔｕｒｅ?ａｓｃｏｍａｔａ?ｏｆ?Ｏ．?ｘｕｅｆｅｎｇｅｎｓｉｓ?（Ｄｒａｗ??ｂｙ?Ｊｉｎｇ?Ｔｉａｎ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｈｏｔｏｔｙｐｅ?ＭＨＨＮＵ７９６６?ａｎｄ?ＧＺＵＨ２０１２ＨＮ１９）．??Ａ：?Ｔｈｅ?ｍａｔｕｒｅ?Ｏ．?ｘｕｅｆｅｎｇｅｎｓｉｓ：?Ｂ：?Ｂｒｏｗｎ，?ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ?ａｓｃｏｍａｔａ?ｏｎ?ｓｔｒｏｍａｔａ；?Ｃ：?Ｓｅｔｉｏｎ?ｏｆ?ａｓｃｏｍａｔａ．??２．?３．?２雪峰虫草菌株子座的培养??将分离出的雪峰虫草接种于子实体培养基上，２个月后于子实体培养基上长出了粗??壮的子座（图２－５）。子座圆柱形，直径为１－６?ｍｍ，长度可达１３０?ｍｍ，生长末端为米色，??生长过程中子座外壁逐渐转变成黄褐色，内部呈米色，质地坚硬，与天然雪峰虫草子座??２１??
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本文编号：2876057