固氮施氏假单胞菌非编码RNA基因crcZ和crcY的转录特性及其RNA稳定性研究

发布时间：2020-11-09 09:17

　　 碳代谢物抑制(Carbon Catabolite Repression,CCR)是指在多种碳源存在条件下,细菌优先利用优势碳源,同时抑制非优势碳源的利用达到最佳生长的现象。研究表明,RNA结合蛋白(如Crc和Hfq)在转录后水平负调控非优势碳源代谢基因的表达,而其与靶标的结合活性受非编码RNA(ncRNA)的竞争抑制。ncRNA与抑制蛋白之间的数量关系影响了菌体对碳源的选择。优势碳源存在时,RNA结合蛋白与靶标基因mRNA结合,抑制相关蛋白表达,菌体不能利用非优势碳源。当优势碳源消耗殆尽时,ncRNA高水平表达,与抑制蛋白结合,靶标mRNA得以释放,细胞开始利用非优势碳源。参与CCR调控的ncRNA广泛存在于假单胞菌中,但不同种中所含的ncRNA种类不同,固氮施氏假单胞菌A1501含有两个ncRNA CrcZ和CrcY,但其表达规律及功能分化尚不清楚。本论文以施氏假单胞菌A1501为试验材料,探究crcZ和crcY基因在不同营养环境中的表达特性及其转录产物的稳定性,取得的主要结果如下:1.分别构建了ncRNA crcZ和crcY的启动子-lacZ融合表达载体PcrcZ-lacZ和PcrcY-lacZ,用于研究不同营养环境下crcZ和crcY的启动子活性。β-半乳糖苷酶酶活测定结果表明,crcZ在LB培养条件下启动子活性最低,为85 U,以优势碳源乳酸钠和非优势碳源葡萄糖为唯一碳源培养条件下的启动子活性相当,均为LB丰富培养条件下的4.9倍;crcY在以上三种培养条件下启动子活性存在显著差异,LB培养条件下最低,为209 U,乳酸钠和葡萄糖分别为唯一碳源条件下启动子活性依次升高,分别是LB培养条件下的2.03倍和3.56倍;相比氮限制条件,固氮条件下crcZ和crcY的启动子活性均变化不大。碳源匮乏相比碳源丰富条件crcZ和crcY启动子活性均升高;在以上测定的培养条件下,crcZ的启动子活性均低于crcY,数字PCR结果显示,CrcZ的胞内拷贝数为crcY的36.8倍,推测这两个ncRNA的稳定性受不同机制调控。2.荧光定量分析和转录活性测定结果表明:苯甲酸为唯一碳源培养条件下,crc(碳代谢抑制控制蛋白编码基因)突变株中,CrcZ的胞内水平和转录活性分别为野生型的0.016倍和0.3倍,CrcY的胞内水平和转录活性分别为野生型的0.21倍和0.18倍,暗示Crc不仅影响了crcZ和crcY基因转录,而且可能影响CrcZ的稳定性。苯甲酸唯一碳源培养条件下,?crc中cbrB和rpoN的表达量相比于野生型下降1倍,推测Crc蛋白通过影响cbrB和rpoN的表达进而正调控crcZ和crcY的转录。RNA稳定性试验结果表明,野生型中CrcZ和CrcY在利福平处理第50 min仍分别保留90%和60%(与处理0 min相比),?crc中CrcZ和CrcY在第17 min即下降50%,表明Crc蛋白正调控CrcZ和CrcY的稳定性。此外,RNA分子伴侣蛋白编码基因hfq的突变株中CrcZ和CrcY水平逐渐降低,在第50 min分别下降21%和36%,而野生型中CrcZ和CrcY在第5 min即下降约40%。上述结果表明,CrcZ和CrcY的稳定性受到Crc和Hfq蛋白的影响。生物信息学分析结果表明,预测的施氏假单胞菌A1501 CrcZ和CrcY的茎环结构的环上富含发挥调控功能的“CA motif”,其附近存在着RNase E的剪切位点(单链AU-rich RNA序列),RNase E可能是CrcZ和CrcY功能调控网络中的一个特异性降解酶。本研究初步探讨了不同生长条件、不同调控节点突变体中非编码基因crcZ和crcY的转录特性及转录产物稳定性,为深入研究碳代谢物抑制与固氮作用的网络调控机制奠定了理论基础。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q933
【部分图文】：

成的圆环形结构即作为三聚体反应的场所，催化活性位点就位于此中央通道内(SymmC-端具有一个 KH 家族保守核苷酸结合结构域和一个 S1 家族保守核苷酸结合结构域组成了供 RNA 分子进入催化活性位点的入口。一旦接近这些结构域，线型 RNA 通过的中央孔（仅允许单链 RNA 通过）接近其中一个活性位点；RNA3′末端的磷酸二酯一个磷酸分子攻击，进而被剪切下来，单链 RNA 以 3′→5′的方向逐渐被降解。体外实H 结构域和催化核心在底物捕获中起关键作用(Wong, 2013)，Carzaniga 等发现 PNPas域通过结合 5′-UTR 抑制自身翻译，实现 PNPase 的自我调节(Carzaniga, 2015)。大肠 还具有稳定某些 sRNA 的功能，似乎与其作为一个降解性核酸外切酶的结论相对 编码基因 pnp 的删除造成包括 CyaR 和 RyhB 在内的一些 sRNA 的不稳定(De Lay, 20RNase Ease E 有两个主要的结构域：N-端核酸酶结构域和 C-端“脚手架”结构域，供其他降解（图 1-1）。N-端具有内切核酸酶活性；C-端除了 6 个微小结构域，主要为固有无序ekaran, 2003)。RNase E 的 C-端序列整体保守性不高，某些局部序列保守性却较高。这微小结构域大小为 20-70 个残基，提供 RNA 降解体其他组分组装、RNA 底物和细胞位点(Vanzo, 1998; Callaghan, 2004; Chandran, 2007; Khemici, 2008)。C-端第一个微小结向序列（MTS），形成亲水脂性的螺旋可与质膜相互作用。

碱基互补配对形成多个茎环结构。在所有细菌和真核生物中部分独立地正向或负向改变靶 RNA 的翻译。不同的小 RN并降解。因此，细菌小 RNA 与真核生物调控 mRNA 翻译的菌及与其同属的致病菌中，sRNA 并不与其靶 mRNA 完全碱要分子伴侣 Hfq 的协助，Hfq 在这里起到的作用是稳定 s不同 sRNA 与相应靶标 mRNA 相互作用对基因的表达可以起定性增强翻译效率或加速 mRNA 降解阻止翻译。细菌中大RNA 的半衰期进而影响翻译(Wagner, 2015)。然而，最新的“降解机器”直接影响 mRNA 稳定性，而不影响翻译(LalaoicC）、mRNA（ompD）和 Hfq 形成的三元复合物可以招募 R），在不影响 RhlB 和烯醇酶与 RNAse E 结合的同时，sR 碳端的识别核心区域相互作用而结合，这个识别并结合的过中，sRNA 的 5′端单磷酸基团与 RNase E 的感应结构域结合的结构域(Bandyra, 2012)（图 1-2）。另外一个例子是，sR点上游 5′-非翻译区碱基配对增加 cfa mRNA 的稳定性，进, 2013)。

士学位论文 第二章 CrcZ 和CrcY的生物信息学和 CrcY 的生物信息学分析old algorithm (http: rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)分别预测了C款在线软件针对一条序列会给出多个预测结果，它们具有不同的自由最低和出现频率最高的结构预测结果。运用蛋白质数据库Uniprot检索及氨基酸序列并使用 DNAMAN 将其与 A1501 RNase E 进行比对。序列，为进一步研究其转录活性奠定基础。在 NCBI 上检索与 CrcZ 和ega7.0 软件绘制出 CrcZ 和 CrcY 的系统进化树。 和 CrcY 生物信息学分析 和 CrcY 系统进化树的构建
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本文编号：2876203