沙冬青AmCSDP基因特性及转基因烟草的抗寒性分析

发布时间：2020-11-10 00:44

【摘要】：冷休克结构域蛋白(CSPs)是含有不同数量冷休克结构域(cold shock domain,CSD)的低温响应蛋白,在低温胁迫中发挥重要作用。以沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)为材料,克隆得到了冷休克结构域蛋白基因AmCSDP。生物信息学分析显示AmCSDP(Gen Bank登录号:KX756575)全长540bp,编码180个氨基酸,二级结构由8.9%的α–螺旋、47.8%的β–折叠和43.3%的无规则卷曲组成,其N端含有冷休克结构域。进化分析表明沙冬青与花生同源性最高。构建了AmCSDP真核表达载体Pcambia2300-35S-AmCSDP-OCS,经农杆菌介导转入本氏烟中。对转基因T1代和野生型烟草进行4℃低温胁迫处理,结果证实转基因本氏烟比野生型的耐冷能力强。
【图文】：

王红蕾，王艳萍，于婷乔，刘胜利，陈玉珍，卢存福.沙冬青AmCSDP基因特性及转基因烟草的抗寒性分析.园艺学报，2017，44(4)：712–722.7151.6真核表达载体的构建及烟草的转化与鉴定选用真核表达载体引物（表1），以沙冬青cDNA为模板构建真核表达载体Pcambia2300-35S-AmCSDP-OCS（方法同1.4），提取质粒转化农杆菌LBA4404。用农杆菌介导的叶盘侵染法将重组载体2300-AmCSDP转化到野生型烟草中，将T1代烟草种子播种在含150mg·L-1卡那霉素的MS培养基上，筛选转基因阳性苗，之后转移至营养土中培养。CTAB法提取T1代不同株系转基因烟草DNA，同时提取总蛋白，PCR和Westernblot检测AmCSDP在烟草中表达。1.7转基因烟草抗寒性鉴定在MS培养基中培养转AmCSDP的T1代烟草种子和野生型烟草种子12h（25℃，16h光照/8h黑暗）。低温处理：4℃处理3h，恢复培养10d后统计发芽率，试验重复3次。取转AmCSDP的T1代株系C2和野生型本氏烟种子各30粒，在MS培养基中长至4片叶后，放入4~6℃黑暗中分别低温处理1h、3h、1d、3d、10d、20d，25℃恢复培养15d后观察植株表型变化并计算存活率。同时，取转AmCSDP的T1代株系C2和野生型本氏烟种子各6粒，营养土中培养42d后，放入4~6℃黑暗中低温胁迫处理7d。冷胁迫后室温恢复培养7d，观察表型变化，进一步分析基因功能。2结果与分析2.1AmCSDP生物信息学分析沙冬青冷休克结构域蛋白基因AmCSDP（GenBank登录号KX756575）的ORF为540bp，预测编码180个氨基酸（图1），其分子式为C934H1477N237O250S10，相对分子质量20.35kD；不稳定参数36.38，其蛋白为不稳定蛋白；总亲水平均系数0.150，为亲水蛋白。图1AmCSDP全长cDNA序列及氨基酸序列Fig.1cDNAfullsequenceandcorrespondingaminoacidsequenceofAmCSDP

2。结果表明，沙冬青最保守，并且沙冬青AmCSDP与豆科的花生（Arachisipaensis）具有更高的同源性。图2AmCSDP与其他含有同源序列植物的系统进化关系Fig.2PhylogeneticanalysisofAmCSDPandotherreportedproteins2.2在大肠杆菌中表达AmCSDPIPTG诱导目的蛋白表达如图3所示，与空对照BP菌相比，CSP1+、CSP2+菌经过IPTG诱导后有约20.3kD的蛋白过量表达，且与AmCSDP理论预测值相同，表明已诱导出所需目的蛋白。将经过IPTG诱导的超表达AmCSDP从聚丙烯酰胺凝胶中切下，用液氮研碎溶于磷酸缓冲液中作为抗原，免疫小白鼠获得抗体。图3AmCSDP在转基因大肠杆菌中表达CSP1、CSP2：不同的BL21克隆中表达AmCSDP；BP：空载体PET30a；“+”：加IPTG诱导；“–”：未加IPTG诱导；M：标准蛋白Marker。Fig.3ExpressionofAmCSDPinE.coliBL21CSP1，CSP2：OverexpressionofAmCSDP；BP：OverexpressionofPET30a；“+”：IPTGinducted；“–”：NotIPTGinduced；M：Standardproteininmarker.

SDP的二级结构由8.9%的α–螺旋、47.8%的β–折叠和43.3%的无规则卷曲组成。将AmCSDP与库中的已知同源蛋白晶体结构比对并进行三维重构。SWISS-MODEL预测了AmCSDP的主链构象，AmCSDP的N端序列含有5个反向平行的β–折叠形成的桶形结构，即冷休克结构域（类S1结构域）。为了进一步研究AmCSDP与其他植物中抗逆蛋白之间的进化关系，用BioEdit及MAGA4.0软件对AmCSDP与13种植物的氨基酸序列进行多重序列比对，并构建系统进化树如图2。结果表明，沙冬青最保守，并且沙冬青AmCSDP与豆科的花生（Arachisipaensis）具有更高的同源性。图2AmCSDP与其他含有同源序列植物的系统进化关系Fig.2PhylogeneticanalysisofAmCSDPandotherreportedproteins2.2在大肠杆菌中表达AmCSDPIPTG诱导目的蛋白表达如图3所示，与空对照BP菌相比，CSP1+、CSP2+菌经过IPTG诱导后有约20.3kD的蛋白过量表达，且与AmCSDP理论预测值相同，表明已诱导出所需目的蛋白。将经过IPTG诱导的超表达AmCSDP从聚丙烯酰胺凝胶中切下，用液氮研碎溶于磷酸缓冲液中作为抗原，免疫小白鼠获得抗体。图3AmCSDP在转基因大肠杆菌中表达CSP1、CSP2：不同的BL21克隆中表达AmCSDP；BP：空载体PET30a；“+”：加IPTG诱导；“–”：未加IPTG诱导；M：标准蛋白Marker。Fig.3ExpressionofAmCSDPinE.coliBL21CSP1，CSP2：OverexpressionofAmCSDP；BP：OverexpressionofPET30a；“+”：IPTGinducted；“–”：NotIPTGinduced；M：Standardproteininmarker.
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本文编号：2877201