多重实时PCR技术用于Ph-like急性淋巴细胞白血病融合基因检测的研究

发布时间：2020-12-08 06:30

　　Ph-like ALL（Philadelphia chromosome-like Acute Lymphoblastic Leukemia）为最新报道的一种ALL亚型,在ALL中约占20%。表达谱聚类分析发现其基因表达与BCR-ABL1阳性ALL（Ph+ALL）相似,临床预后也相似,但不存在BCR-ABL1融合基因。Ph-like ALL涉及激酶信号通路异常活化和一系列细胞因子受体基因异常,并常伴有淋系发育相关转录因子异常。近几年研究发现,基于Ph-like ALL分子遗传学异常,使用相应的酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）联合化疗可以显著改善Ph-like ALL的疗效。因此,检测Ph-like ALL相关的分子遗传学异常具有重要的临床意义。本研究采用实时PCR技术平台,以Ph-like ALL相关的32种融合基因和一项独立预后因素为检测对象,结合媒介探针技术和HAND系统（Homo-Tag Assisted Non-Dimer）,建立四管多重实时PCR的检测方法,可检测与Ph-like ALL相关的32种融合基因（42种以上的融合形式）和一项独立预后因素。首先通过文献调研确认每种融合基因... 

【文章来源】：厦门大学福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１－２?ＣＯＧ的Ｐｈ－ｌｉｋｅ?ＡＬＬ诊断方案丨６６丨??Ｆｉｇｕｒｅｌ－２?Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ?ａｌｇｏｒｉｔｈｍ?ｆｏｒ?ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ?Ｐｈ－ｌｉｋｅ?ＡＬＬ．??

起到封闭作用，防止其结合到靶ＤＮＡ后延伸；另一条是通用检测探针??（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｐｒｏｂｅ），为分子信标其５＇端标记荧光基团和３＇端标记萍??灭基团，其中分子信标的茎序列的３＇区有一段序列为媒介子杂交区域（图１－??３?Ａ）。??基于分子信标媒介探针技术的工作流程如下：（１）引物和媒介探针退火结合。??在ＰＣＲ过程中的变性步骤，模板的ＤＮＡ双链分开，上下游引物和媒介探针??的靶特异序列分别与模板的ＤＮＡ相应的链杂交（图１－３?Ｂ１）；?（２）引物延伸??和媒介探针被切。引物在延伸过程中，由于媒介探针５＇区媒介子不与靶ＤＮＡ??匹配，因此媒介子被具有５＇—３＇外切酶活性的ＤＮＡ聚合酶切断（该酶切位点??主要是在媒介探针上靶结合序列与靶互补的第一个和第二个碱基中间切断）??［７５，７６］，从而使媒介子被切下并暴露出３ｆ－０Ｈ，而与靶互补的探针则被消化成??碎片［７６］（图１－３Ｂ２）；?（３）媒介子的退火和延伸。再下一轮的ＰＣＲ退火过程，??暴露出３ｆ－ＯＨ的媒介子杂交在分子信标通用检测探针的环序列上并延伸，打??开分子信标的茎序列

（＿＿０３２６８２．５），其中，別７户２／４－／４５１／存在３种融合形式（图２－１八）。具体的??断裂点见图２－１。Ｊ５Ｚ７的断裂点有ｅｘｏｎ２、ｅｘｏｎ３和ｅｘｏｎ４，考虑到扩增子的长??度不能太长，所以上设计了两条下游引物和两条媒介探针，断裂点ｅｘ〇ｎ２??和ｅｘｏｎ?３共用下游引物和媒介探针。媒介探针和其他上游引物的设计位点如图??２－１?Ｂ所示。??Ａ??ＥＴＶ６－ＡＢＬｌ（ｅ５？２）?ＲＣＳＤＪ－ＡＢＬｌ（ｅ２－ｅ４）??ｉ?５?Ｉ?ｉ２１?一３?ｉ?ｍｆｍ?丨４一?｜５｜??ＮＵＰｍ－ＡＢＬＨｅｎ－．Ｄ＾ｌ）?（ｅ３４－ｅ３）?５，Ｖ＾－．？Ｉ／（ｅ３－ｅ４）????３２?｜?３３?｜?３４］?Ｉ?２?Ｉ?３?￣Ｉ?Ｉ?２?｜￣＊３?Ｖｆ????￣Ｉ￣Ｉ?■■一、??ＺＸＨＺｌ－ＡＢＬＪ（ｅ＼Ｓ－ｅ２）??３２?３２?２?３?一?—????ｒ＾ｎ?￣￣????ＲＴＩ￣１７?Ｉ?１８丨?２?３￣??３２?３３?３４?３?４???????????????ＦＯＸＰＪ－ＡＢＬＪ（ｅ［９－ｅ４）??Ｒ．４ＮＢ

【参考文献】：
期刊论文
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[5]Ph样急性淋巴细胞白血病的分子遗传学进展:第56届美国血液学会年会报道[J]. 张阳,刘红星.  白血病·淋巴瘤. 2015 (02)
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硕士论文
[1]流式细胞术检测儿童白血病细胞磷酸化信号蛋白的初步研究[D]. 李华梅.广州医学院 2011
[2]多色实时PCR用于食源性致病菌的广谱检测与识别[D]. 张佳峰.厦门大学 2007



本文编号：2904629