超表达中间锦鸡儿CiHARBI1基因影响转基因拟南芥子叶形态建成

发布时间：2020-12-13 00:03

　　器官形状的控制是一个基本的发育生物学过程,截至目前,植物器官形状的调控机制仍未被阐明。叶是植物体的基本营养器官,其形态结构的改变很大程度上影响植物对非生物胁迫信号的响应。研究调控叶发生、发育的分子机理,对于完善人类对整个植物体的发育过程及抗逆机理的认识具有重要意义。HARBI1蛋白（Harbinger Transposase Derived 1）属于DDE_Tnp₄蛋白家族,目前对于HARBI1在植物中功能尚没有研究。本文以拟南芥（Arabidopsis thaliana）为实验材料,对从中间锦鸡儿（Caragana intermedia Kuang et H.C.Fu）干旱处理的转录组数据库中筛选得到的多胁迫响应基因CiHARBI1基因进行了克隆及功能研究。主要结果如下:1.从中间锦鸡儿中克隆得到一个非生物胁迫相关的DDE_Tnp₄家族基因CiHARBI1。CiHARBI1的表达受到干旱和NaCl的快速诱导。2.在拟南芥中异源超表达CiHARBI1后,高量超表达植株和中等程度超表达植株子叶顶轴位置形成... 

【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区

【文章页数】：76 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
缩略语表
1 引言
    1.1 HARBI1蛋白
        1.1.1 HARBI1蛋白的分子结构特征
        1.1.2 HARBI1蛋白理化性质
        1.1.3 HARBI1蛋白研究进展
    1.2 双子叶植物叶片发育研究进展
        1.2.1 子叶的形成
        1.2.2 叶原基的极性分化
        1.2.3 植物激素对拟南芥叶片发育的调控
    1.3 细胞分裂素
        1.3.1 细胞分裂素的合成
        1.3.2 细胞分裂素的降解
        1.3.3 细胞分裂素的信号转导途径
    1.4 生长素
        1.4.1 生长素的生物合成
        1.4.2 生长素的降解
        1.4.3 生长素的信号转导途径
    1.5 中间锦鸡儿
    1.6 研究目的和意义
    1.7 技术路线
2 实验材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌种
        2.1.3 质粒
    2.2 实验药品
        2.2.1 实验试剂及酶
        2.2.2 试剂盒
        2.2.3 引物设计
        2.2.4 培养基及所需其他化学试剂的配制
    2.3 实验仪器
    2.4 实验方法
        2.4.1 植物材料培养与处理方法
        2.4.2 植物gDNA、总RNA提取及cDNA的获得
        2.4.3 基因表达量的检测
        2.4.4 中间锦鸡儿CiHARBI1全长cDNA的克隆
        2.4.5 目的片段胶回收
        2.4.6 目的基因与克隆载体的连接
        2.4.7 目的片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞
        2.4.8 质粒提取
        2.4.9 中间锦鸡儿CiHARBI1基因序列分析
        2.4.10 启动子克隆及分析
        2.4.11 中间锦鸡儿CiHARBI1基因表达载体的构建
        2.4.12 拟南芥的遗传转化
        2.4.13 转基因植物纯合体的筛选
        2.4.14 超表达植株的表型观察
        2.4.15 GUS组织化学染色
        2.4.16 GFP亚细胞定位观察
        2.4.17 超表达株系激素含量的测定
3 结果与分析
    3.1 中间锦鸡儿CiHARBI1基因全长cDNA的克隆
    3.2 中间锦鸡儿CiHARBI1生物信息学分析
        3.2.1 中间锦鸡儿CiHARBI1基因序列分析
        3.2.2 CiHARBI1蛋白理化性质分析
        3.2.3 CiHARBI1蛋白的二级结构预测
        3.2.4 CiHARBI1蛋白功能结构域预测和分析
        3.2.5 CiHARBI1蛋白与其他物种HARBI1类蛋白多重比对
        3.2.6 CiHARBI1蛋白的系统进化树分析
    3.3 中间锦鸡儿CiHARBI1基因表达特性分析
    3.4 CiHARBI1基因超表达纯合体的筛选及表达量的检测
        3.4.1 超表达载体pCanG-CiHARBI1的构建
        3.4.2 超表达CiHARBI1转基因株系的获得
        3.4.3 超表达纯合体中CiHARBI1的表达水平检测
    3.5 转基因拟南芥表型分析
        3.5.1 超表达植株子叶顶轴位置形成凹陷
        3.5.2 超表达植株子叶叶表皮细胞交联度改变
        3.5.3 高量超表达株系细胞分裂素反应及叶片玻璃化现象
        3.5.4 超表达植株莲座叶形态改变
        3.5.5 超表达植株抽薹时间较晚
    3.6 CiHARBI1的亚细胞定位观察
        3.6.1 CiHARBI1的GFP融合载体的构建
        3.6.2 CiHARBI1在稳定表达株系中的亚细胞定位观察
    3.7 CiHARBI1的启动子克隆与GUS组织化学染色
        3.7.1 CiHARBI1的启动子克隆及顺式作用元件分析
        3.7.2 CiHARBI1的启动子驱动GUS报告基因表达载体构建
        3.7.3 GUS组织化学染色
    3.8 CiHARBI1转基因拟南芥中激素含量发生变化
        3.8.1 高量超表达植株细胞分裂素含量明显上升
        3.8.2 高量超表达植株生长素含量有所下降
4 讨论
    4.1 CiHARBI1的序列分析及功能预测
    4.2 CiHARBI1的表达模式分析
    4.3 CiHARBI1通过调控生长素稳态影响扁平细胞分化
    4.4 CiHARBI1的作用方式可能具有剂量效应进而调控了子叶叶片形态
    4.5 CiHARBI1超表达对植物激素含量的影响
5 结论
致谢
参考文献
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]生长素对拟南芥叶片发育调控的研究进展[J]. 李林川,瞿礼嘉.  植物学通报. 2006(05)

博士论文
[1]中间锦鸡儿3个非生物胁迫相关转录因子的克隆与功能分析[D]. 韩晓敏.内蒙古农业大学 2015
[2]中间锦鸡儿带状林地根系和土壤水分特征及抗旱性研究[D]. 德永军.内蒙古农业大学 2009
[3]异三聚体G蛋白在生长素介导的拟南芥侧根发育中的作用机理研究[D]. 吴晓霞.扬州大学 2008
[4]调控拟南芥叶早期发育的重要基因AS1，AS2的克隆及功能分析[D]. 孙越.中国科学院研究生院（上海生命科学研究院） 2002

硕士论文
[1]柠条锦鸡儿咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因cDNA和gDNA全长克隆及生物信息学分析[D]. 张烨.内蒙古农业大学 2011



本文编号：2913501