谷子弯孢菌阿魏酸酯酶基因的克隆及在毕赤酵母中的外源表达

发布时间：2020-12-13 08:44

　　本文从长清团山采集的富含植物纤维的腐土样中,利用阿魏酸乙酯平板法—透明圈法对土样中产阿魏酸酯酶的菌株进行了筛选,结果得到7株有透明圈的菌株,其中1株的透明圈复筛的水解圈显著,将其命名为QU108。菌株QU108的菌落表面凹凸不平,有放射状皱褶,菌丝初期为白色,随培养时间的延长颜色逐渐加深,最后为黑色,显微镜下观察到孢子梗着生的分生孢子≤3个,孢子弯曲如新月,被隔膜隔成3隔室。PCR扩增了该菌的18S rDNA基因,产物大小为1638bp,Blast同源分析显示和Cochliobolus sp.的同一性高达99%,初步判定菌株QU108属于弯孢菌属。根据通用引物扩增了菌株QU108的ITS序列,其长度为336bp,同源比对结果显示和Cochliobolus lunatus的同一性高达到100%。根据形态学观察和分子生物学鉴定,可以确定所分离的菌株属真菌界、真菌门、丛梗孢目、丛梗孢科、旋孢腔菌属的谷子弯孢菌。以黑曲霉阿魏酸酯酶A的蛋白序列为目标序列,在谷子弯孢菌全基因组序列中通过BlastP比对获得其阿魏酸酯酶A的基因候选序列。采用PCR技术克隆得到谷子弯孢菌QU108的阿魏酸酯酶A的基因... 

【文章来源】：齐鲁工业大学山东省

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
    1.1 阿魏酸酯酶
    1.2 阿魏酸酯酶的分类和来源
    1.3 阿魏酸酯酶的生产
        1.3.1 固体发酵生产阿魏酸酯酶
        1.3.2 阿魏酸酯酶的分子克隆
    1.4 阿魏酸酯酶的应用
        1.4.1 植物生物质的预处理
        1.4.2 阿魏酸酯酶在羟基肉桂酸释放中的应用
        1.4.3 阿魏酸酯酶在生物质加工中的应用
        1.4.4 阿魏酸及其相关精细化学品的生产应用
        1.4.5 阿魏酸酯酶制浆造纸工业的应用
        1.4.6 阿魏酸酯酶在饲料工业中的应用
        1.4.7 阿魏酸酯酶在调味料和酒精饮料工业的应用
    1.5 本论文的研究目的及内容
第2章 产阿魏酸酯酶谷子弯孢菌的分离及鉴定
    2.1 材料和方法
        2.1.1 试验材料
        2.1.2 试验方法
    2.2 实验结果与分析
        2.2.1 分离产阿魏酸酯酶的丝状真菌
        2.2.2 产阿魏酸酯酶菌株QU108的形态观察
        2.2.3 产阿魏酸酯酶菌株QU108的分子鉴定
    2.3 本章小结
第3章 谷子弯孢菌阿魏酸酯酶A基因的分离及生物信息学分析
    3.1 试验材料
        3.1.1 菌种与质粒
        3.1.2 培养基及相关试剂
        3.1.3 主要仪器
    3.2 试验方法
        3.2.1 谷子弯孢菌QU108染色体DNA的提取
        3.2.2 谷子弯孢菌QU108阿魏酸酯酶A基因序列检索
        3.2.3 谷子弯孢菌QU108阿魏酸酯酶A基因的PCR扩增
        3.2.4 谷子弯孢菌faeA的PCR产物回收
        3.2.5 谷子弯孢菌faeA的PCR产物和T载体重组连接
        3.2.6 谷子弯孢菌faeA的DNA序列测定
        3.2.7 谷子弯孢菌阿魏酸酯酶基因和蛋白质的生物信息学分析
    3.3 试验结果与分析
        3.3.1 谷子弯孢菌QU108菌株染色体DNA的提取
        3.3.2 谷子弯孢菌QU108阿魏酸酯酶A基因的克隆
        3.3.3 谷子弯孢菌QU108阿魏酸酯酶A生物信息学分析
    3.4 本章小结
第4章 谷子弯孢菌QU108阿魏酸酯酶基因在毕赤酵母中的表达
    4.1 试验材料
        4.1.1 菌株
        4.1.2 培养基及相关溶液
        4.1.3 工具酶和试剂
        4.1.4 主要仪器
    4.2 试验方法
        4.2.1 谷子弯孢菌QU108阿魏酸酯酶A cDNA基因的克隆
        4.2.2 谷子弯孢菌QU108阿魏酸酯酶A表达载体pPIC9k-ClfaeA的构建
        4.2.3重组质粒pPIC9k-ClfaeA转化毕赤酵母GS115
        4.2.4 重组毕赤酵母转化子的筛选
        4.2.5 阿魏酸酯酶活性测定方法
        4.2.6 毕赤酵母转化子发酵液的SDS-PAGE分析
        4.2.7 重组阿魏酸酯酶A酶学性质测定
    4.3 试验结果与分析
        4.3.1 表达载体pPIC9K-ClfaeA的构建及线性化
        4.3.2 载体pPIC9K-ClfaeA电转化毕赤酵母
        4.3.3 毕赤酵母faeA活性转化子的筛选
        4.3.4 毕赤酵母转化子发酵液上清的SDS-PAGE分析
        4.3.5 温度对重组阿魏酸酯酶A的影响
        4.3.6 pH对重组阿魏酸酯酶A的影响
    4.4 本章小结
全文总结及展望
参考文献
致谢



本文编号：2914268