利用CRISPR/Cas9技术对果蝇的多个基因位点进行编辑
发布时间：2020-12-16 09:21
基因的原位编辑修饰一直被认为是生物学实验中最困难也是最关键的部分,研究者通过对特定基因的原位编辑可以了解更多关于基因的功能、基因所调控的信号通路的细节。本文对于目的基因的原位编辑主要是通过CRISPR/Cas9技术将光转蛋白基因序列敲入果蝇的多个基因位点中。从细菌中发现的CRISPR/Cas9系统在许多生物体中被证明是非常高效强大的基因编辑工具。成规律的成簇的非连续的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）是一类在细菌中发现的DNA片段,在这些片段中包含了来自于攻击过这类细菌的病毒的DNA片段。这些片段最初是被细菌用来检测和摧毁含有与之相似序列的病毒,其和CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated protein,Cas）构成了细菌的防御免疫系统。人们通过基因工程改造了Ⅱ型的CRISPR/Cas系统即我们所称的CRISPR/Cas9系统,使得基因的原位编辑效率大大提高。形成素基因是TGF-β信号通路的配体,其调控生物体发育,pattern的形成和干细胞的分化。它们的产...
【文章来源】：福州大学福建省 211工程院校
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１?ＺＦＮ基因编辑原理简图（引自网络）??
于免疫记忆中的记忆Ｔ细胞，当含有同样序列的外源ＤＮＡ再次入侵时，该外源ＤＮＡ??可以被细菌的ＣＲ１ＳＰＲ免疫机制识别，并进行剪切使得外源ＤＮＡ表达沉默，进而达??到保护细菌自身安全的目的（图１－４）。在这里行使ＤＮＡ剪切功能的是ＣＲＩＳＰＲ相??关蛋白９，在Ｃａｓ９上有２个酶切活性位点可以切割ＤＮＡ，其靶向介质是ＲＮＡ，我们将??其称为向导ＲＮＡ?（ｇＲＮＡ）。??除了主角Ｃａｓ９外，还有一些其他的Ｃａｓ蛋白，也会促进ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的编??辑能力。例如：帮助获得新的重复序列的Ｃａｓｌ和Ｃａｓ２蛋白；具有解旋酶和核酸酶??功能的Ｃａｓ３蛋白。当然也有一些Ｃａｓ蛋白的功能目前尚且不太清楚。???Ａ?ＣＲＩＳＰＲ?Ｌｏｃｕｓ???Ｓｐａｃｅｒｓ??／?１?＼??＇ｆ?＼?＂＼｛???＃??＂???、??Ｖ?ｋ?Ｊ?ｇ??ＣＡＳ?Ｇｅｎｅｓ?Ｌｅａｄｅｒ?＼?＼?／?／??Ｒｅｐｅａｔｓ??Ａ?ＣＲＩＳＰＲ?Ａｒｒａｙ??图卜４?ＣＲＩＳＰＲ的序列结构简图（引自网络）Ｌｅａｄｅｒ：位于ＣＲＩＳＰＲ簇上游，富含ＡＴ序列，长度约??３００－５００ｂｐ，可能是启动子．Ｒｅｐｅａｔ：为重复序列区，其长度约为２１？４８ｂｐ，并且其中含有回文序列，可以??形成发夹结构．Ｓｐａｃｅｒ：即重复序列中的间隔区域，其长度约为２６？７２ｂｐ，由被俘获的外源ＤＮＡ组成．ＣＡＳ??Ｇｅｎｅｓ：编码ＣＲＩＳＰＲ相关Ｃａｓ蛋白基因．??１．３．?３?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的基因原位编辑机制原理??前文我们提到过目前人们发现了三种不同类型的ＣＲＩＳＰＲ系统，其中由于ＩＩ??型ＣＲＩＳＰＲ系统比较简单
比例选取果蝇提基因组并进行第一轮分子鉴定。本课题的果蝇第一轮分子鉴定的??阳性标签是ＫＩ片段中ｄｅｎｄｒａ蛋白核酸序列中的一部分（引物设计位点见图??３－１，３－６，?３－９）。??（３）若第一轮分子鉴定出现阳性管，则从每个阳性管中分别再挑选１０只Ｆ１Ｒ??雄蝇，再次与双平衡子品系一对一杂交，待其有后代后，对父母本中的雄蝇（原??Ｆ１代雄蝇）进行第二轮分子鉴定。第二轮分子鉴定引物设计位点为原同源臂５’??端上游３０（＾口处和同源臂３’端下游３０（＾口处（图３－１，３－５，３－８）。为降低？〇？??难度，可将第二轮分子鉴定引物与第一轮分子鉴定引物结合使用。以Ｄｐｐ为例（图??３－１），第二轮分子鉴定的目的片段：５’端ｆｌａｎｋ?（使用５’ＤｐｐＦＰ，ｄｅｎｄｒａＲＰ这对??弓丨物）３’端ｆｌａｎｋ（使用ｄｅｎｄｒａＦＰ，?３’?ＤｐｐＲＰ这对引物）。??（４）若第二轮分子鉴定出现阳性管，将阳性管的ＰＣＲ产物５’端Ｈａｎｋ和３’端??ｆｌａｎｋ送测序，确认其不是脱靶的ＫＩ阳性品系，并确认其没有发生移码或错义??突变。??（５）完成鉴定后，从第二轮分子鉴定阳性管中挑选类似ＫＩ／平衡子的基因型保??种，并将含有相同平衡子的ＫＩ／平衡子果蝇进行一对一杂交，构建纯合的ＫＩ??果绳品系。??
【参考文献】：
期刊论文
[1]TALENs:植物基因组定点剪辑的分子剪[J]. 赵开军,杨兵. 中国农业科学. 2012(14)
[2]锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用[J]. 钟强,赵书红. 遗传. 2011(02)
本文编号：2919924
【文章来源】：福州大学福建省 211工程院校
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１?ＺＦＮ基因编辑原理简图（引自网络）??
于免疫记忆中的记忆Ｔ细胞，当含有同样序列的外源ＤＮＡ再次入侵时，该外源ＤＮＡ??可以被细菌的ＣＲ１ＳＰＲ免疫机制识别，并进行剪切使得外源ＤＮＡ表达沉默，进而达??到保护细菌自身安全的目的（图１－４）。在这里行使ＤＮＡ剪切功能的是ＣＲＩＳＰＲ相??关蛋白９，在Ｃａｓ９上有２个酶切活性位点可以切割ＤＮＡ，其靶向介质是ＲＮＡ，我们将??其称为向导ＲＮＡ?（ｇＲＮＡ）。??除了主角Ｃａｓ９外，还有一些其他的Ｃａｓ蛋白，也会促进ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的编??辑能力。例如：帮助获得新的重复序列的Ｃａｓｌ和Ｃａｓ２蛋白；具有解旋酶和核酸酶??功能的Ｃａｓ３蛋白。当然也有一些Ｃａｓ蛋白的功能目前尚且不太清楚。???Ａ?ＣＲＩＳＰＲ?Ｌｏｃｕｓ???Ｓｐａｃｅｒｓ??／?１?＼??＇ｆ?＼?＂＼｛???＃??＂???、??Ｖ?ｋ?Ｊ?ｇ??ＣＡＳ?Ｇｅｎｅｓ?Ｌｅａｄｅｒ?＼?＼?／?／??Ｒｅｐｅａｔｓ??Ａ?ＣＲＩＳＰＲ?Ａｒｒａｙ??图卜４?ＣＲＩＳＰＲ的序列结构简图（引自网络）Ｌｅａｄｅｒ：位于ＣＲＩＳＰＲ簇上游，富含ＡＴ序列，长度约??３００－５００ｂｐ，可能是启动子．Ｒｅｐｅａｔ：为重复序列区，其长度约为２１？４８ｂｐ，并且其中含有回文序列，可以??形成发夹结构．Ｓｐａｃｅｒ：即重复序列中的间隔区域，其长度约为２６？７２ｂｐ，由被俘获的外源ＤＮＡ组成．ＣＡＳ??Ｇｅｎｅｓ：编码ＣＲＩＳＰＲ相关Ｃａｓ蛋白基因．??１．３．?３?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的基因原位编辑机制原理??前文我们提到过目前人们发现了三种不同类型的ＣＲＩＳＰＲ系统，其中由于ＩＩ??型ＣＲＩＳＰＲ系统比较简单
比例选取果蝇提基因组并进行第一轮分子鉴定。本课题的果蝇第一轮分子鉴定的??阳性标签是ＫＩ片段中ｄｅｎｄｒａ蛋白核酸序列中的一部分（引物设计位点见图??３－１，３－６，?３－９）。??（３）若第一轮分子鉴定出现阳性管，则从每个阳性管中分别再挑选１０只Ｆ１Ｒ??雄蝇，再次与双平衡子品系一对一杂交，待其有后代后，对父母本中的雄蝇（原??Ｆ１代雄蝇）进行第二轮分子鉴定。第二轮分子鉴定引物设计位点为原同源臂５’??端上游３０（＾口处和同源臂３’端下游３０（＾口处（图３－１，３－５，３－８）。为降低？〇？??难度，可将第二轮分子鉴定引物与第一轮分子鉴定引物结合使用。以Ｄｐｐ为例（图??３－１），第二轮分子鉴定的目的片段：５’端ｆｌａｎｋ?（使用５’ＤｐｐＦＰ，ｄｅｎｄｒａＲＰ这对??弓丨物）３’端ｆｌａｎｋ（使用ｄｅｎｄｒａＦＰ，?３’?ＤｐｐＲＰ这对引物）。??（４）若第二轮分子鉴定出现阳性管，将阳性管的ＰＣＲ产物５’端Ｈａｎｋ和３’端??ｆｌａｎｋ送测序，确认其不是脱靶的ＫＩ阳性品系，并确认其没有发生移码或错义??突变。??（５）完成鉴定后，从第二轮分子鉴定阳性管中挑选类似ＫＩ／平衡子的基因型保??种，并将含有相同平衡子的ＫＩ／平衡子果蝇进行一对一杂交，构建纯合的ＫＩ??果绳品系。??
【参考文献】：
期刊论文
[1]TALENs:植物基因组定点剪辑的分子剪[J]. 赵开军,杨兵. 中国农业科学. 2012(14)
[2]锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用[J]. 钟强,赵书红. 遗传. 2011(02)
本文编号：2919924
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/2919924.html
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