Fat1基因打靶绒山羊的鉴定分析

发布时间：2021-01-13 22:21

　　Fat1基因编码n-3多不饱和酸脱氢酶,可以将多不饱和脂肪酸从n-6转化为n-3形式,提高动物体内n-3的含量。由于人体不能自身合成n-3多不饱和脂肪酸,只能从食物中摄取,因此将Fat1基因转入家畜体内具有广泛的应用前景。MSTN基因属于转化生长因子β超家族,是骨骼肌生长发育的负调控因子,MSTN基因突变的动物会表现出肌肉过度肥大的现象,称为“双肌现象”,双肌动物与普通动物相比,具有生长速度快、瘦肉率高而脂肪含量低的特点。CRISPR/Cas9基因编辑技术由于成本低、操作简单、切割效率高等特点,被应用于基因敲除、定点敲入、多位点同时敲除等技术领域中。实验室于2016年获得了Fat1基因定点整合入MSTN基因中的基因打靶绒山羊。本研究对得到的基因打靶绒山羊进行了PCR、Southern Blot、Western Blot、实时定量PCR、脂肪酸含量、肌纤维直径、血常规以及血液生化分析等方面的检测,探讨Fat1基因定点整合、MSTN基因敲除对相关基因表达以及基因打靶绒山羊健康的影响。1)外源基因整合鉴定采集Fat1基因打靶绒山羊的血液,提取基因组进行PCR鉴定,分离了Fat1基因打靶绒山羊... 

【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校

【文章页数】：84 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

基因打靶载体元件

GAPDH 36 0.2A /1h10minMSTN 27 0.2A /1h验结果外源基因整合的鉴定1 耳尖成纤维细胞的培养本实验采用组织块贴壁法分离绒山羊的耳尖成纤维细胞。培养 5 天后有成纤维细胞从爬出（见图 1.2A），约 10 天长到 80%-90%汇合度，将细胞传代一次后冻存，解冻后用图 1.2B 为解冻后传代一次的细胞）。从图中可以看出，从组织块爬出的细胞长势良好形态为梭型，经过传代培养的耳尖成纤维细胞长势良好，可供后续实验使用。

掠瓮?幢?PCR 产物以及 867bp Fat1 随机插入产物（如图1.3），测序，与预期相符，初步证明外源基因 Fat1 成功定点整合到 MSTN 位点。图 1.3 基因打靶绒山羊 PCR 鉴定M:250bp DNA maker；1：跨上游同源臂 PCR 产物，1560bp；2：跨下游同源臂 PCR 产物，1767bp；3：Fat1基因 PCR 产物 867bp；4：质粒 PCR 阳性对照 867bpFig1.3 Electrophoresis of PCR productionM:250bp DNA maker;1: amplification of the 5’- junction,1560bp; 2:amplification of the 3’- junction,1767bp;3:fat-1 random integration PCR product,867bp:4:plasmid positive control,867bp3.1.3 Southern Blot 检测3.1.3.1 Southern Blot 探针合成琼脂糖凝胶电泳分离鉴定 PCR 产物，得到的片段大小及测序与预期结果相符，运用地高辛标记 PCR 胶回收产物并进行探针效率检测。如图 1.4 ， PCR 产物条带明亮、单一，测序结果完全正确，可用于后续 Southern Blot 实验。34


本文编号：2975653