产双果糖酐Ⅲ的菊糖果糖基转移酶的基因克

发布时间：2021-01-22 06:25

　　双果糖酐Ⅲ（difructo se anhydride,DFA Ⅲ）是近年来发现的一种新型天然功能性甜味剂,具有促进矿物质吸收、促进骨骼生长、改善便秘等功能,而且甜度较高但能量较低,并具有良好的理化性质,适用于烘焙、饮料、医药制剂中。但是DFA Ⅲ在自然界中含量较低,利用提取分离的手段获得产品的成本较高;而通过利用化学法制备DFA Ⅲ也存在产物中同分异构体较多,分离纯化困难,并且污染环境等问题。因此,该产品目前主要是采用生物法制备:利用菊糖果糖基转移酶（IFTase）催化菊糖分解生成DFA Ⅲ。该方法转化率高,安全可靠,并且菊糖来源广泛,适用于大规模工业化生产,是近年来研究的热点。但是现有的IFTase普遍存在酶活性不高,转化率低,生产成本高等问题,因此利用现代分子生物学手段获得新的IFTase,提高催化效率,降低转化成本对于推动DFA Ⅲ的广泛应用十分重要。本研究首先通过生物信息分析,对IFTase的氨基酸序列进行对比,通过分子克隆和表达,获得来源于克雷伯氏菌的目的基因编码的酶Kp-IFTase。经初步鉴定,该酶具有催化菊糖分解生成双果糖苷Ⅲ及其它果寡糖的功能。该酶具有良好的耐热性并... 

【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省

【文章页数】：104 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

DFAIII的结构

糖果糖基转移酶的催化反应机理naka 等（1972）从土壤中筛选到首株产菊糖果糖转移酶的产脲节杆微生物能够分泌这种以菊糖为底物，催化降解为双果糖 III（DF首次提出该反应是一个分子内转果糖基，随后 Uchiyama（1975）该假设，并提出该酶的催化反应机制如下：在适宜条件下，IFTa从菊糖分子的非还原性果糖基末端以两个果糖基为单位，依次水1）糖苷键。并且该酶同时催化分子内转果糖基反应，催化两个果2）糖苷键。等（2007）的研究中获得来源于芽孢杆菌的 IFTase 的蛋白晶体结1-2 所示：此酶是三聚体结构，每个单体形成右手平行的 β-螺旋，别该折叠方式，并且每个单体的整体呈圆柱形状，399 个残基形成芽孢杆菌 IFTase 的结构呈现了 β-螺旋蛋白的一般结构特征，但同，每个螺旋圈由 2, 3 或 4 个 β 折叠组成，并且在相邻转弯处的行片。

沈阳农业大学硕士学位论文于 F1 的内部位点，另外两个位于 F2 上。在催化反应中，与 IFTase 内部端果糖基单元 F1 作为受体，入口处的 F2 作为供体，而且菊粉内剩余的果化反应的离去基团，因此，F2 果糖基将发生异头构型的反转。Glu244 是础，其羧基进攻果糖基 F1 的羟基，使其去质子化。Asp233 在催化反应中它是唯一和 F2 直接作用的残基单位，将供体 F2 分子定位到催化的最佳构化的 F1 的 O-3 更有效的进行发生亲核攻击反应，攻击 F2 上的 C-2，生成键，最终果二糖从菊粉上脱落（Jung et al，2007）。


本文编号：2992740