Gluconobacter thailandicus D-阿拉伯糖醇脱氢酶和木糖醇脱氢酶基因的克隆及协同表达

发布时间：2017-04-11 20:07

  本文关键词：Gluconobacter thailandicus D-阿拉伯糖醇脱氢酶和木糖醇脱氢酶基因的克隆及协同表达，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：木糖醇因其甜度高、热量低且代谢不受胰岛素影响等特性而备受关注,在食品、医药和化工等领域得到广泛应用,在国际市场上供不应求。近年来,随着绿色发展和可持续发展理念越来越深入人心,人们的环保意识增强,生物法生产木糖醇逐渐成为各国学者开展研究的重点。D-阿拉伯糖醇脱氢酶(D-arabitol dehydrogenase,ArDH)和木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase,XDH)作为木糖醇生物合成途径中的关键酶和限速酶,它们的高效表达对D-阿拉伯糖醇转化生产木糖醇起着至关重要的作用。因此,构建高性能的基因工程菌,对于木糖醇生产效率的提高以及工业化生产具有重要的意义。本论文利用PCR技术从泰国葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter thailandicus)中扩增出ArDH的编码基因ardh,构建重组质粒pET28a-ardh,并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中得到了高效表达;ardh的表达产物经SDS-PAGE分析显示有27kDa特异性蛋白条带出现,纯化蛋白并测定其酶学性质。当以D-木酮糖为底物时,还原反应的最适温度为30℃,最适pH约为5.0,还原反应的比活为11.46U/mg,对D-木酮糖的Km值为27mmol/L,Vmax为22.3μmol/min/mg;当以D-阿拉伯糖醇为底物时,氧化反应最适温度为30℃,最适pH约为9.0,氧化反应的比活为27.72U/mg,对D-阿拉伯糖醇的Km值为12.5mmol/L,Vmax为52.8μmol/min/mg。同时,克隆并表达了来自G.thailandicus的XDH的编码基因xdh,构建重组质粒pET28a-xdh,并在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中得到了高效表达。SDS-PAGE分析结果显示重组菌BL21(DE3)-xdh有28kDa特异性蛋白条带出现。经过金属镍亲和层析及Sephacryl S-300凝胶层析纯化后,系统地测定其酶学性质。当以D-木酮糖为底物时,还原反应的最适温度为30℃,最适pH约为5.0,还原反应的比活为126.3U/mg,对D-木酮糖的Km值为11.2mmol/L,Vmax为134.2μmol/min/mg;当以木糖醇为底物时,氧化反应最适温度为35℃,最适pH约为11.0,氧化反应的比活为28.6U/mg,对木糖醇的Km值为78.6mmol/L,Vmax为53.6μmol/min/mg。利用重组质粒pET28a-xdh和pET28a-ardh构建重组质粒pET28a-xdh-ardh,并转入E.coli BL21(DE3),实现了xdh和ardh基因的协同表达。对重组菌BL21(DE3)-xdh-ardh和原始菌G.thailandicus分别进行摇瓶发酵,发酵结果表明重组菌BL21(DE3)-xdh-ardh的木糖醇产量为23.7 g/L,原始菌G.thailandicus的木糖醇产量为12.9 g/L。重组菌从D-阿拉伯糖醇到木糖醇的转化率为29.6%,相较于原始菌从D-阿拉伯糖醇到木糖醇的转化率16.1%有较大提高。
【关键词】：木糖醇 泰国葡萄糖酸杆菌 木糖醇脱氢酶 D-阿拉伯糖醇脱氢酶 协同表达
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TS201.3
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 绪论12-25
• 1.1 木糖醇的概述12-13
• 1.2 化学加氢合成木糖醇13-14
• 1.3 生物转化生成木糖醇14-21
• 1.3.1 以木糖为底物产木糖醇14-16
• 1.3.2 以葡萄糖为底物产木糖醇16-21
• 1.4 立题意义21-23
• 1.5 研究内容23-24
• 1.6 技术路线24-25
• 第二章 ardh基因在E.coli中的克隆表达及酶学性质测定25-45
• 2.1 引言25-26
• 2.2 材料26-28
• 2.2.1 菌株和质粒26
• 2.2.2 主要酶和试剂26
• 2.2.3 培养基26-27
• 2.2.4 主要仪器设备27-28
• 2.3 实验方法28-37
• 2.3.1 菌体的培养和G. thailandicus总DNA的提取28-29
• 2.3.2 ArDH工程菌的构建29-32
• 2.3.3 ArDH的诱导表达及纯化32-34
• 2.3.4 ArDH酶学性质研究34-37
• 2.4 结果与讨论37-44
• 2.4.1 重组质粒pET-28a-ardh的构建37-38
• 2.4.2 ardh基因的序列分析38-39
• 2.4.3 重组酶的SDS-PAGE分析、纯化及比活力测定39-41
• 2.4.4 ArDH的酶学性质41-44
• 2.6 本章小结44-45
• 第三章 xdh基因在E.coli的克隆表达及酶学性质测定45-59
• 3.1 引言45
• 3.2 材料45-46
• 3.2.1 菌株和质粒45
• 3.2.2 主要酶和试剂45
• 3.2.3 培养基45
• 3.2.4 主要仪器设备45-46
• 3.3 实验方法46-51
• 3.3.1 菌体的培养和G. thailandicus总DNA的提取46
• 3.3.2 XDH工程菌的构建46-48
• 3.3.3 XDH的诱导表达及纯化48
• 3.3.4 XDH酶学性质研究48-51
• 3.4 结果与讨论51-58
• 3.4.1 重组质粒pET-28a-xdh的构建51-52
• 3.4.2 xdh基因的序列分析52-53
• 3.4.3 重组酶的SDS-PAGE分析、纯化及比活力测定53-55
• 3.4.4 XDH的酶学性质55-58
• 3.6 本章小结58-59
• 第四章 xdh和ardh基因在E.coli中的协同表达与D-阿拉伯糖醇的转化59-67
• 4.1 引言59
• 4.2 材料59-60
• 4.2.1 菌株和质粒59
• 4.2.2 主要酶和试剂59
• 4.2.3 培养基59-60
• 4.2.4 主要仪器设备60
• 4.3 实验方法60-63
• 4.3.1 菌体的培养和质粒的提取60
• 4.3.2 分子克隆操作60-62
• 4.3.3 重组菌的诱导表达62
• 4.3.4 摇瓶发酵生产木糖醇62-63
• 4.4 结果分析63-66
• 4.4.1 重组质粒pET28a-xdh-ardh的构建63-64
• 4.4.2 xdh和ardh基因协同表达产物的SDS-PAGE电泳分析64-65
• 4.4.3 摇瓶发酵65-66
• 4.5 本章小结66-67
• 第五章 全文总结与展望67-70
• 5.1 主要结论67-68
• 5.2 展望68-70
• 参考文献70-77
• 致谢77-78
• 在学期间发表的学术论文及其他科研成果78

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本文编号：299858