基于CRISPR/Cas9技术构建人CLCN7基因编辑载体

发布时间：2021-02-02 17:05

　　目的为修复石骨症致病基因（CLCN7）进行前期探索,采用CRISPR/Cas9技术构建CLCN7基因编辑表达载体。方法根据sgRNA设计原则,在CLCN7外显子区设计一对sgRNA,合成四条单链DNA寡核苷酸,退火后连接于CRISPR/Cas9质粒的BspQ I酶切位点处,然后转染感受态大肠杆菌DH5α,并通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,扩大培养。结果最后经过PCR和Sanger测序鉴定获得了两个基因编辑表达载体CLCN7-sg1RNA-CRISPR-Cas9和CLCN7-sg2RNACRISPR-Cas9。结论基因编辑载体的成功构建为CLCN7突变修复提供了工作基础。 

【文章来源】：实验与检验医学. 2020,38(03)

【文章页数】：4 页

【部分图文】：

CRISPR/Cas9质粒图谱

在重组质粒CLCN7-sg1RNA-CRISPR/Cas9和CLCN7-sg2RNA-CRISPR/Cas9的构建过程中,分别将线性化载体与寡核苷酸使用T4连接酶连接,并转化至TOP10细胞中，并分别挑取8个克隆，扩培后提取质粒，使用DNA引物CC-CX-F和CC-CX-R进行PCR分析,见表1与图4,结果表明除了重组质粒CLCN7-sg1RNA-CRISPR/Cas9的6号克隆和CLCN7-sg2RNA-CRISPR/Cas9的16号克隆外均为阳性克隆；最后，选取阳性克隆进行Sanger测序，结果显示阳性克隆成果插入了目的序列sg1RNA和sg2R NA，碱基序列与预期一致,见图5和图6，证实重组质粒CLCN7-sg1RNA-CRISPR/Cas9和CLCN7-sg2RNA-CRISPR/Cas9已构建成功。图5 重组质粒CLCN7-sg1RNA-CRISPR/Cas9的测序结果

重组质粒CLCN7-sg1RNA-CRISPR/Cas9的测序结果

【参考文献】：
期刊论文
[1]人类尿液来源干细胞的体外培养和生物学特性分析[J]. 牛鑫,张国威,汪泱.  实验与检验医学. 2017(05)
[2]基因组测序技术及其临床应用研究进展[J]. 梁振山,曾令兵,万腊根.  实验与检验医学. 2016(01)
[3]CRISPR/Cas9基因组编辑技术及其在动物基因组定点修饰中的应用[J]. 周金伟,徐绮嫔,姚婧,余树民,曹随忠.  遗传. 2015(10)



本文编号：3015061