塞内加谷病毒四川株的分离鉴定、全基因序列分析及其3C蛋白的真核表达

发布时间：2021-02-10 01:31

　　猪塞内加谷病毒（Seneca Valley virus,SVV）可引起猪鼻镜及蹄冠处出现水疱、溃烂创面从而导致跛足甚至死亡,并具有传染性,对猪群危害重大。近几年来,SVV在世界各地频繁暴发,但由于其临床症与口蹄疫等病毒相似而被忽视,因此对该病毒开展的组织培养特性、病理学特点以及分子生物学特性的系统性研究具有重要意义。本研究采集四川眉山和遂宁等地区疑似SVV感染猪群的水疱液病变组织等原始病料,检测后选择SVV阳性病料无菌处理后接种PK-15细胞进行病毒分离。结果两组病料皆在盲传过程中使PK-15细胞出现CPE,传至10代后,接毒24h稳定出现典型CPE,表现为个别细胞变圆,并随着时间的增加大量细胞堆积破碎,漂浮于液面上。对分离的病毒株进行挑斑纯化,经RT-PCR检测证实成功分离出两株SVV毒株,将其命名为SVV-MS株和SVV-SN株。经测定,SVV-MS株和SVV-SN株的TCID₅₀分别为10^-5.66/0.1 mL and 10^-6.12/0.1 mL。将SVV-SN株分别对2-3日龄及7-9日龄乳鼠进行攻毒,经鉴定... 

【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要缩略词
第一章 文章综述
    1 塞内加谷病毒及其发现
    2 SVV的基因组结构及其功能
        2.1 5'UTR与3'UTR
        2.2 SVV的多蛋白前体
        2.3 SVV的结构蛋白
        2.4 SVV的非结构蛋白
    3 SVV细胞培养特性
    4 SVV的致病性
        4.1 临床症状
        4.2 解剖症状
    5 SVV的流行病学
    6 SVV的鉴别诊断与预防
    7 研究目的与意义
第二章 SVV-MS株和SVV-SN株的分离与鉴定
    1 试验材料
        1.1 实验动物
        1.2 主要酶和试剂
        1.3 病料、细胞与质粒
        1.4 主要仪器
        1.5 主要配制试剂
    2 试验方法
        2.1 引物的设计与合成
        2.2 病料的处理与RT-PCR检测
        2.3 SVV的分离与培养
            2.3.1 细胞的复苏与培养
            2.3.2 SVV的分离与培养
            2.3.3 SVV的蚀斑纯化
            2.3.4 病毒TCID50 的测定
        2.4 乳鼠攻毒实验
    3 结果分析
        3.1 病料检测结果
        3.2 SVV的分离与培养
        3.3 RT-PCR检测
        3.4 SVV TCID50 的测定
        3.5 乳鼠攻毒实验
    4 讨论
第三章 SVV-MS株和SVV-SN株全基因测序与分析
    1 试验材料
        1.1 主要酶及试剂
        1.2 毒株、细胞及质粒
        1.3 主要仪器
        1.4 主要配制试剂
    2 试验方法
        2.1 引物的设计与合成
        2.2 SVV的增殖
        2.3 RNA的提取
        2.4 SVV的 c DNA合成
            2.4.1 5'-UTR与3'-UTR的 c DNA合成
            2.4.2 ORF的 c DNA合成
        2.5 SVV基因组的扩增
            2.5.1 5'-UTR与3'-UTR的 c DNA扩增
            2.5.2 ORF的 c DNA的扩增
        2.6 目的片段的回收
        2.7 重组质粒的构建
            2.7.1 目的基因与质粒的连接
            2.7.2 感受态细胞的制备
            2.7.3 转化
        2.8 全基因组序列分析
    3 结果分析
        3.1 全基因的分段扩增与克隆
        3.2 全基因组的序列拼接
        3.3 全基因序列特征及与遗传进化树分析
            3.3.1 全基因序列同源性分析
            3.3.2 全基因遗传进化树分析
            3.3.3 VP1 基因序列同源性分析
            3.3.4 VP1 基因遗传进化树分析
            3.3.5 VP1 基因氨基酸序列分析
    4 讨论
第四章 SVV-3C基因真核质粒的构建表达
    1 试验材料
        1.1 主要酶及试剂
        1.2 质粒、菌种、细胞和毒株
        1.3 主要实验仪器
        1.4 主要配制试剂
    2 试验方法
        2.1 SVV3C蛋白序列的扩增
            2.1.1 设计扩增SVV3C蛋白的引物
            2.1.2 扩增SVV3C蛋白序列
            2.1.3 目的片段回收
            2.1.4 回收后目的片段与pMD19-T载体重组质粒的构建
            2.1.5 质粒抽提
        2.2 SVV3C蛋白的生物信息学分析
        2.3 SVV3C蛋白真核质粒的构建
            2.3.1 载体及目的片段的酶切和回收
            2.3.2 3C序列与表达载体pcDNA3.1（+）的连接
            2.3.3 连接产物转化
            2.3.4 重组质粒鉴定
                2.3.4.1 重组质粒PCR鉴定
                2.3.4.2 重组质粒双酶切鉴定
                2.3.4.3 真核表达重组质粒的序列测定
        2.4 SVV3C蛋白真核质粒的表达
            2.4.1 质粒抽提（无内毒素）
            2.4.2 转染
            2.4.3 样品制备
            2.4.4 SDS-PAGE电泳
            2.4.5 免疫印迹
        2.5 SVV3C蛋白对帽样结构依赖蛋白的影响
            2.5.1 pcDNA3.1（+）-SVV-3C和 pEGFP-N1 的共转染
            2.5.2 观察及免疫印迹法验证
    3 结果分析
        3.1 SVV3C蛋白序列的扩增
        3.2 SVV3C蛋白生物信息学分析
            3.2.1 SVV3C基因结构分析
            3.2.2 二级结构分析
            3.2.3 SVV3C蛋白真核质粒的构建
        3.3 SVV3C蛋白真核质粒的表达
        3.4 SVV3C蛋白对帽样结构依赖蛋白的影响
            3.4.1 荧光显微镜观察
            3.4.2 免疫印迹法验证
    4 讨论
全文总结
参考文献
致谢
作者简历
    一、个人基本情况
    二、教育经历
    三、攻读学位期间发表的学术论文



本文编号：3026562