高抗水稻白叶枯病相关新基因的克隆及抗病机制研究
发布时间：2021-03-06 01:50
水稻白叶枯病是由Xanthomonas oryzae pv.oryzae（Xoo）引起的一种毁灭性病害,可造成水稻大量减产。抗病品种的利用是一种经济且对环境友好的防治手段,但是其前提是需要不断挖掘新的抗白叶枯病基因资源并明确抗病基因功能。本研究利用前期诱变获得的广谱高抗白叶枯病的水稻类病变突变体hpil3开展了抗病目标基因定位、克隆,蛋白组学,目标基因的互作基因筛选等相关研究,同时对疣粒野生稻中RCA在抗白叶枯病中的作用机理进行了研究。主要研究成果如下:利用hpil3和其野生型大粒香水稻通过基于重测序的图位克隆策略成功定位并克隆了该突变体的目标基因。该基因定位在4号染色体的20-22Mb区域内,进一步筛选得到7个候选的基因。通过对突变位点的验证和生物信息学分析最终确定了一个可能性较大的候选基因。转基因功能互补验证结果表明,该野生型基因成功使hpil3的表型恢复为野生型并丧失了对白叶枯病的抗性,从而确证了该候选基因就是hpil3的目标基因。通过实时荧光定量PCR发现hpil3中病程相关基因PR1a、PR1b、PR5、PR10表达量显著高于其野生型大粒香（DLX）,而PR9略高于DLX;未...
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：140 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
用基因组重测序的方法定位突变体hpil3目标基因Fig.2.3Genemappingofhpil3throughgenomeresequencing
沈阳农业大学博士学位论文392.3.3hpil3候选目标基因的克隆和超表达载体的构建将提取好的总RNA逆转录为cDNA，用全长引物15M41F/R进行扩增（图2.4-a）。先将PCR产物凝胶纯化回收，先与入门载体pB2E-T连接（图2.4-b），再将目标片段通过LR反应转移至超表达载体pCAMBIA1300-DEST中（图2.4-c）。图2.4hpil3候选目标基因的检测a:目标基因的克隆;b:目标基因连接入门载体pB2E-T的检测图片;c:目标基因连接超表达载体pCAMBIA1300-DESTFig.2.4testoncandidategeneofhpil3a:thetestpictureofhpil3tagetgenecloned,b:thetestpictureofhpil3tagetgeneconnecttedentryvectorpB2E-T,c:hpil3tagetgeneconnectedoverexpressvectorpCAMBIA1300-DEST2.3.4hpil3目标基因超表达植株的转化将构建完成的含野生型目标基因的超表达载体通过农杆菌转化hpil3（图2.5），转化工作由上海博益生物公司完成。
沈阳农业大学博士学位论文41株则表现出高抗（图2.6）。这与分子鉴定的结果相一致，说明该候选基因就是突变体hpil3的目标基因。图2.6转基因植株表型鉴定和分子鉴定A、B：转基因的hpil3植株；C：转基因hpil3植株的抗性鉴定和分子鉴定hpil3-OE：转基因阳性植株；hpil3-VA：转基因阴性植株A、B：thephenotypeoftransgenichpil3;C:theresistanceidentificationandmolecularidentificationoftransgenichpil3；hpil3-OE：positiveplantbytransgenosis；hpil3-VA：nagativeplantbytransgenosis2.4讨论本试验通过基于基因组重测序的图位克隆的方法将hpil3的目标基因定位在4号染色体20-22Mb区间，进一步筛选得到7个候选基因，在NCBI和RAP-DB等网站的基因信息比对后最终将一个可能性最大候选基因做水稻转基因功能互补验证，得到17株恢复野生表型的转基因植株和4株未恢复植株。对它们做白叶枯病抗性鉴定，结果表明表型恢复的植株跟其野生型一样对白叶枯病菌表现出高感，而未恢复的植株跟突变体一样是高抗的。这进一步验证了该候选基因就是hpil3的目标基因。查阅文献发现该基因是未被报道过的一个水稻类病变新基因。其在网站RiceGenomeAnnotationProject
【参考文献】：
期刊论文
[1]木质部次生细胞壁增厚参与疣粒野生稻对黄单胞杆菌水稻变种的抗性(英文)[J]. 杨勇,谢礼,严成其,王栩鸣,余初浪,成晓越,程晔,陈剑平. 植物病理学报. 2012(05)
[2]利用基因组文库加速Xa23基因定位的染色体步移[J]. 王春连,陈乐天,曾超珍,张群宇,刘丕庆,刘耀光,樊颖伦,章琦,赵开军. 中国水稻科学. 2006(04)
[3]疣粒野生稻原生质体再生小植株[J]. 朱永生,陈葆棠,秦发兰,余舜武,张端品. 中国农业科学. 2002(12)
博士论文
[1]中国番茄黄化曲叶病毒卫星DNA抑制转录后基因沉默的机理研究[D]. 李方方.浙江大学 2014
[2]Xa13基因在水稻—白叶枯病菌互作和水稻生长发育中的功能研究[D]. 袁猛.华中农业大学 2010
[3]Rubisco活化酶大小同工型与水稻光合作用的关系研究[D]. 王盾.浙江大学 2009
本文编号：3066231
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：140 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
用基因组重测序的方法定位突变体hpil3目标基因Fig.2.3Genemappingofhpil3throughgenomeresequencing
沈阳农业大学博士学位论文392.3.3hpil3候选目标基因的克隆和超表达载体的构建将提取好的总RNA逆转录为cDNA，用全长引物15M41F/R进行扩增（图2.4-a）。先将PCR产物凝胶纯化回收，先与入门载体pB2E-T连接（图2.4-b），再将目标片段通过LR反应转移至超表达载体pCAMBIA1300-DEST中（图2.4-c）。图2.4hpil3候选目标基因的检测a:目标基因的克隆;b:目标基因连接入门载体pB2E-T的检测图片;c:目标基因连接超表达载体pCAMBIA1300-DESTFig.2.4testoncandidategeneofhpil3a:thetestpictureofhpil3tagetgenecloned,b:thetestpictureofhpil3tagetgeneconnecttedentryvectorpB2E-T,c:hpil3tagetgeneconnectedoverexpressvectorpCAMBIA1300-DEST2.3.4hpil3目标基因超表达植株的转化将构建完成的含野生型目标基因的超表达载体通过农杆菌转化hpil3（图2.5），转化工作由上海博益生物公司完成。
沈阳农业大学博士学位论文41株则表现出高抗（图2.6）。这与分子鉴定的结果相一致，说明该候选基因就是突变体hpil3的目标基因。图2.6转基因植株表型鉴定和分子鉴定A、B：转基因的hpil3植株；C：转基因hpil3植株的抗性鉴定和分子鉴定hpil3-OE：转基因阳性植株；hpil3-VA：转基因阴性植株A、B：thephenotypeoftransgenichpil3;C:theresistanceidentificationandmolecularidentificationoftransgenichpil3；hpil3-OE：positiveplantbytransgenosis；hpil3-VA：nagativeplantbytransgenosis2.4讨论本试验通过基于基因组重测序的图位克隆的方法将hpil3的目标基因定位在4号染色体20-22Mb区间，进一步筛选得到7个候选基因，在NCBI和RAP-DB等网站的基因信息比对后最终将一个可能性最大候选基因做水稻转基因功能互补验证，得到17株恢复野生表型的转基因植株和4株未恢复植株。对它们做白叶枯病抗性鉴定，结果表明表型恢复的植株跟其野生型一样对白叶枯病菌表现出高感，而未恢复的植株跟突变体一样是高抗的。这进一步验证了该候选基因就是hpil3的目标基因。查阅文献发现该基因是未被报道过的一个水稻类病变新基因。其在网站RiceGenomeAnnotationProject
【参考文献】：
期刊论文
[1]木质部次生细胞壁增厚参与疣粒野生稻对黄单胞杆菌水稻变种的抗性(英文)[J]. 杨勇,谢礼,严成其,王栩鸣,余初浪,成晓越,程晔,陈剑平. 植物病理学报. 2012(05)
[2]利用基因组文库加速Xa23基因定位的染色体步移[J]. 王春连,陈乐天,曾超珍,张群宇,刘丕庆,刘耀光,樊颖伦,章琦,赵开军. 中国水稻科学. 2006(04)
[3]疣粒野生稻原生质体再生小植株[J]. 朱永生,陈葆棠,秦发兰,余舜武,张端品. 中国农业科学. 2002(12)
博士论文
[1]中国番茄黄化曲叶病毒卫星DNA抑制转录后基因沉默的机理研究[D]. 李方方.浙江大学 2014
[2]Xa13基因在水稻—白叶枯病菌互作和水稻生长发育中的功能研究[D]. 袁猛.华中农业大学 2010
[3]Rubisco活化酶大小同工型与水稻光合作用的关系研究[D]. 王盾.浙江大学 2009
本文编号：3066231
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