番茄中介体基因SlMed23的克隆和功能研究
发布时间：2021-03-27 04:22
中介体（Mediator Complex）是广泛存在于动物、植物和微生物中的一类多蛋白复合物,其空间构象由头部、中部、尾部和激酶模块构成,在真核生物的转录调控中发挥关键的桥梁作用。对植物中介体的研究多集中在拟南芥,比如控制胚胎的形成、芽分生组织的发育、影响开花时间、根毛生成等。此外,它还参与非生物胁迫的响应。番茄作为一种广泛种植的蔬菜作物,具有重要的经济价值。而且,它还是用于科学研究的模式植物。然而,干旱、高盐等不良环境对番茄的生长和产量造成极大的损害。目前对番茄中介体参与非生物胁迫响应的研究知之甚少,所以,对番茄抗性基因的深入探究显得至关重要。本研究利用生物信息学方法从番茄中筛选出SlMed23基因,构建沉默载体,利用农杆菌介导的遗传转化方法转化至番茄,通过RNA干扰技术沉默该基因的表达。此后,通过qRT-PCR技术探究SlMed23在番茄各个生长发育时期的表达水平,并检测其相关发育时期的生理生化指标,以期对SlMed23基因参与番茄生长发育的调控和在非生物胁迫中的功能进行初步的探究。主要研究内容如下所示:（1）由生物进化树分析可得,番茄SlMed23基因和拟南芥AtMed23具有较...
【文章来源】：重庆大学重庆市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：106 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
SlMED23与拟南芥中介体氨基酸序列间的进化关系
2SlMed23基因的生物信息学分析15如图2.2所示。图2.2SlMED23与其他物种中介体MED23氨基酸序列间的进化关系。Bd：B.distachyon，二穗短柄草；Zm：Z.mays，玉米；Sb：S.bicolor，高粱；Os：O.sativa，水稻；Sem：S.moellendorffii，卷柏；At：A.thaliana，拟南芥；Sl：S.lycopersicum，番茄。Figure2.2EvolutionaryrelationshipbetweenaminoacidsequencesofSlMED23andMED23ofotherspecies.通过进化树可以看出，AtMED23与SlMED23氨基酸序列最为同源，聚为一类，而与SemMED23较远，同源性较低。在拟南芥中，Dolan等[73]发现，Atmed5b突变体植株生长矮小，苯丙素的生物积累受到抑制，如果在这个突变体中抑制AtMed23的表达，则可将Atmed5b突变体恢复至野生型状态。由此可见，AtMed23在苯丙素的生物合成中发挥着重要的作用。而AtMED23与SlMED23氨基酸序列有着较高的相似性，这暗示了SlMed23可能具有和拟南芥AtMed23类似的生物学功能。2.2.3SlMED23与AtMED23蛋白的序列比对分析为了进一步明确SlMED23和AtMED23蛋白质序列间的相似程度，对它们进行了蛋白质序列比对分析，如图2.2所示。
3SlMed23基因的表达模式23SlEF1α：F：5’-TACTGGTGGTTTTGAAGCTG-3’R：5’-AACTTCCTTCACGATTTCATCATA-3’②qRT-PCR反应的最适温度目标引物的PCR反应受退火温度的影响，因此探究引物的最适温度尤为重要。本研究使用的qRT-PCR仪器由美国Bio-rad公司生产，将不同的试剂加入与定量PCR仪相匹配的qRT-PCR管中，然后采用两步法反应程序寻找SlMed23引物的最适温度。反应体系：试剂体积2×GoTaqqPCRMasterMix5.0μLqSlMed23（F+R）0.5μL模板1.5μL水（Promega）3.0μL总计10.0μL反应程序：图3.1两步法反应程序Figure3.1Two-stepReactionProcedure反应结束后，根据结果选择峰值最高的溶解曲线，找到对应的温度即为SlMed23的最适温度，实验结果显示目标引物的最适温度是62.3°C。③标准曲线的绘制标准曲线可以用来检测qRT-PCR的条件是否达到最优，可以将反转录的模板cDNA进行一系列的稀释（1倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍等），然后分析反应结果，将其制成标准曲线，经分析，定量引物满足要求，因此，可用该引物检测SlMed23在番茄不同组织以及在不同胁迫和激素处理下的表达水平，
【参考文献】：
期刊论文
[1]Seed Priming with Beta-Amino Butyric Acid Improves Abiotic Stress Tolerance in Rice Seedlings[J]. Kolothodi Chandran JISHA,Jos Thomas PUTHUR. Rice Science. 2016(05)
[2]玉米中介体亚基ZmMED7基因的克隆及表达分析[J]. 王晶,赵军,宗娜. 生物技术进展. 2016(05)
[3]Cloning and Sequence Analysis of Polygalacturonase（PG） Promoter in Tomato[J]. Siming HOU,Liying ZHOU,Lulu BU,Chunlei YANG,Ting GAO,Tian TIAN,Zheng’an YANG. Agricultural Biotechnology. 2016(02)
[4]大豆中介体亚基基因鉴定及表达特性分析[J]. 魏荷,李海朝,练云,雷晨芳,武永康,李金英,王丰青. 大豆科学. 2016(01)
博士论文
[1]番茄SlNAC4和SlDEAD31基因在果实成熟及非生物胁迫响应中的功能研究[D]. 朱明库.重庆大学 2015
[2]水稻OsMPEC基因及拟南芥胁迫诱导microRNA的分离及其功能分析[D]. 刘涵华.山东农业大学 2008
硕士论文
[1]高温诱导番茄柱头外露的生理及分子基础的研究[D]. 王燕.浙江大学 2015
[2]番茄滞绿基因LeSGR1的克隆和功能研究[D]. 严波.重庆大学 2007
本文编号：3102876
【文章来源】：重庆大学重庆市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：106 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
SlMED23与拟南芥中介体氨基酸序列间的进化关系
2SlMed23基因的生物信息学分析15如图2.2所示。图2.2SlMED23与其他物种中介体MED23氨基酸序列间的进化关系。Bd：B.distachyon，二穗短柄草；Zm：Z.mays，玉米；Sb：S.bicolor，高粱；Os：O.sativa，水稻；Sem：S.moellendorffii，卷柏；At：A.thaliana，拟南芥；Sl：S.lycopersicum，番茄。Figure2.2EvolutionaryrelationshipbetweenaminoacidsequencesofSlMED23andMED23ofotherspecies.通过进化树可以看出，AtMED23与SlMED23氨基酸序列最为同源，聚为一类，而与SemMED23较远，同源性较低。在拟南芥中，Dolan等[73]发现，Atmed5b突变体植株生长矮小，苯丙素的生物积累受到抑制，如果在这个突变体中抑制AtMed23的表达，则可将Atmed5b突变体恢复至野生型状态。由此可见，AtMed23在苯丙素的生物合成中发挥着重要的作用。而AtMED23与SlMED23氨基酸序列有着较高的相似性，这暗示了SlMed23可能具有和拟南芥AtMed23类似的生物学功能。2.2.3SlMED23与AtMED23蛋白的序列比对分析为了进一步明确SlMED23和AtMED23蛋白质序列间的相似程度，对它们进行了蛋白质序列比对分析，如图2.2所示。
3SlMed23基因的表达模式23SlEF1α：F：5’-TACTGGTGGTTTTGAAGCTG-3’R：5’-AACTTCCTTCACGATTTCATCATA-3’②qRT-PCR反应的最适温度目标引物的PCR反应受退火温度的影响，因此探究引物的最适温度尤为重要。本研究使用的qRT-PCR仪器由美国Bio-rad公司生产，将不同的试剂加入与定量PCR仪相匹配的qRT-PCR管中，然后采用两步法反应程序寻找SlMed23引物的最适温度。反应体系：试剂体积2×GoTaqqPCRMasterMix5.0μLqSlMed23（F+R）0.5μL模板1.5μL水（Promega）3.0μL总计10.0μL反应程序：图3.1两步法反应程序Figure3.1Two-stepReactionProcedure反应结束后，根据结果选择峰值最高的溶解曲线，找到对应的温度即为SlMed23的最适温度，实验结果显示目标引物的最适温度是62.3°C。③标准曲线的绘制标准曲线可以用来检测qRT-PCR的条件是否达到最优，可以将反转录的模板cDNA进行一系列的稀释（1倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍等），然后分析反应结果，将其制成标准曲线，经分析，定量引物满足要求，因此，可用该引物检测SlMed23在番茄不同组织以及在不同胁迫和激素处理下的表达水平，
【参考文献】：
期刊论文
[1]Seed Priming with Beta-Amino Butyric Acid Improves Abiotic Stress Tolerance in Rice Seedlings[J]. Kolothodi Chandran JISHA,Jos Thomas PUTHUR. Rice Science. 2016(05)
[2]玉米中介体亚基ZmMED7基因的克隆及表达分析[J]. 王晶,赵军,宗娜. 生物技术进展. 2016(05)
[3]Cloning and Sequence Analysis of Polygalacturonase（PG） Promoter in Tomato[J]. Siming HOU,Liying ZHOU,Lulu BU,Chunlei YANG,Ting GAO,Tian TIAN,Zheng’an YANG. Agricultural Biotechnology. 2016(02)
[4]大豆中介体亚基基因鉴定及表达特性分析[J]. 魏荷,李海朝,练云,雷晨芳,武永康,李金英,王丰青. 大豆科学. 2016(01)
博士论文
[1]番茄SlNAC4和SlDEAD31基因在果实成熟及非生物胁迫响应中的功能研究[D]. 朱明库.重庆大学 2015
[2]水稻OsMPEC基因及拟南芥胁迫诱导microRNA的分离及其功能分析[D]. 刘涵华.山东农业大学 2008
硕士论文
[1]高温诱导番茄柱头外露的生理及分子基础的研究[D]. 王燕.浙江大学 2015
[2]番茄滞绿基因LeSGR1的克隆和功能研究[D]. 严波.重庆大学 2007
本文编号：3102876
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