基于CRISPR/Cas9系统的水稻OsMPK15基因编辑
发布时间：2021-04-12 13:14
促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）普遍存在于包括酵母、植物、哺乳动物等在内的真核生物中,在进化过程中高度保守,已明确的功能包括细胞分裂、细胞分化、生物与非生物胁迫应答、激素应答等,涉及生物生长发育的全过程。实验室前期从日本晴水稻根组织中克隆了水稻MAPK基因OsMPK15的cDNA编码区,并发现OsMPK15基因在水稻多种组织中呈现差异表达特征,其中在叶和叶鞘中表达量最高。该基因对环境胁迫信号和激素信号均有响应,其中对干旱和ABA最为敏感。提示该基因可能涉及水稻叶片的相关功能,极有可能还参与水稻非生物胁迫应答过程。为鉴定OsMPK15基因的功能,本文采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建OsMPK15基因敲除水稻,旨在进一步研究该基因在水稻生长发育中的作用。采用CRISPR/Cas9技术构建了OsMPK15基因敲除载体,通过农杆菌介导的方法转化日本晴水稻愈伤组织,经筛选获得3个纯合转基因株系,分别命名为mpk15-1、mpk15-7、mpk15-8。靶位点特异性分析显示,3个株系均未发生脱靶效应。观察比较mpk15-...
【文章来源】：河南师范大学河南省
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR/Cas系统作用的3个阶段（引自MakarovaKS，2011）
Cas9 包含两个瓣叶结构，分别为识别瓣叶和核酸酶瓣叶[13]。识别瓣叶 gRNA：DNA 复合体的识别与结合，核酸酶瓣叶负责切割 DNA 双链。核酸酶瓣叶包含 HNH 和 RuvC 两个核酸结构域[14]，用来切割和降解传元件。NHN 切割与 sgRNA 互补结合的 DNA 单链，RuvC 切割另一，这两个核酸结构域各司其职，对入侵的外源遗传元件进行切割或降通过靶序列 20 个核苷酸的简单改造，Cas9 可重新编辑以靶向切割任何，靶向序列通过碱基互补配对引导至靶基因位点，需要注意的是，所选因位点后必须紧接着 5'-NGG-3（'protospacer-adjacent motif, PAM）位点对于化脓性链球菌 Cas9（Streptococcus pyogenes Cas9，SpCas9）的活性少的。将 crRNA 与 tracrRNA 融合，在 5'末端插入 20bp 的靶序列（间隔 sgRNA[15,16]。sgRNA 的改造使 CRISPR/Cas9 系统最大限度地简化为两Cas9 蛋白和 sgRNA，从而创建了一个简单、高效的基因组工程工具。
配酶切割法法利用的是一类特殊的 DNA 酶，它们能够在单个或多个核苷酸形行切割，包括 T7 endonuclease I, T7EI、Surveyor 核酸酶、Cruise酶在错配碱基位点上的活性显著高于正确互补配对的碱基位点。因首先是 PCR 扩增靶序列，然后待检测 DNA 扩增产物与野生型 D合，高温变性后，退火形成 DNA 杂交双链，进而采用 EMC 法检糖凝胶电泳图中条带数目和片段大小来判断靶序列上是否存在 1-3）。与 PCR/RE 法相比 EMC 法适用于任何靶序列，使用更为也可以在一定程度上切割非错配的同源双链 DNA[65,66]，所以检测CR / RE 法，同时也比较耗时费力[9,60]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening[J]. Yufeng Hua,Chun Wang,Jian Huang,Kejian Wang. Journal of Genetics and Genomics. 2017(04)
[2]彩叶草对模拟干旱胁迫的生理响应[J]. 刘爱荣,张远兵,张雪平,王雪娟,黄守程,谢宜勤. 广西植物. 2015(05)
[3]Heterotrimeric G protein α subunit is involved in rice brassinosteroid response[J]. Lei Wang~(1,2) Yun-Yuan Xu~1 Qi-Bin Ma~(1,2) Dan Li~(1,2) Zhi-Hong Xu~(1,3) Kang Chong~(1,3) 1 Key Laboratory of Photosynthesis and Environmental Molecular Physiology,Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences,Nanxincun 20,Xiangshan,Beijing 100093,China,2 Graduate School of the Chinese Academv of Sciences,100046 Beijing,China;3 National Plant Gene Research Center (Beijing),Beijing 100093,China. Cell Research. 2006(12)
[4]紫外分光光度技术测定植物细胞中H2O2的含量[J]. 夏金婵,苗雨晨,宋纯鹏,苗琛. 四川大学学报(自然科学版). 2005(06)
[5]花粉的保存及其生活力测定[J]. 王钦丽,卢龙斗,吴小琴,陈祖铿,林金星. 植物学通报. 2002(03)
[6]抗坏血酸过氧化物酶活性测定的探讨[J]. 沈文飚,徐朗莱,叶茂炳,张荣铣. 植物生理学通讯. 1996(03)
[7]植物胚胎学实验方法 (一)花粉生活力的测定[J]. 胡适宜. 植物学通报. 1993(02)
[8]杏果实成熟衰老过程中活性氧和几种生理指标的变化(简报)[J]. 任小林,李嘉瑞. 植物生理学通讯. 1991(01)
[9]水稻叶片叶绿素含量与株型的关系及叶位叶绿素含量的变化[J]. 沈福成. 贵州农业科学. 1986(01)
本文编号：3133359
【文章来源】：河南师范大学河南省
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR/Cas系统作用的3个阶段（引自MakarovaKS，2011）
Cas9 包含两个瓣叶结构，分别为识别瓣叶和核酸酶瓣叶[13]。识别瓣叶 gRNA：DNA 复合体的识别与结合，核酸酶瓣叶负责切割 DNA 双链。核酸酶瓣叶包含 HNH 和 RuvC 两个核酸结构域[14]，用来切割和降解传元件。NHN 切割与 sgRNA 互补结合的 DNA 单链，RuvC 切割另一，这两个核酸结构域各司其职，对入侵的外源遗传元件进行切割或降通过靶序列 20 个核苷酸的简单改造，Cas9 可重新编辑以靶向切割任何，靶向序列通过碱基互补配对引导至靶基因位点，需要注意的是，所选因位点后必须紧接着 5'-NGG-3（'protospacer-adjacent motif, PAM）位点对于化脓性链球菌 Cas9（Streptococcus pyogenes Cas9，SpCas9）的活性少的。将 crRNA 与 tracrRNA 融合，在 5'末端插入 20bp 的靶序列（间隔 sgRNA[15,16]。sgRNA 的改造使 CRISPR/Cas9 系统最大限度地简化为两Cas9 蛋白和 sgRNA，从而创建了一个简单、高效的基因组工程工具。
配酶切割法法利用的是一类特殊的 DNA 酶，它们能够在单个或多个核苷酸形行切割，包括 T7 endonuclease I, T7EI、Surveyor 核酸酶、Cruise酶在错配碱基位点上的活性显著高于正确互补配对的碱基位点。因首先是 PCR 扩增靶序列，然后待检测 DNA 扩增产物与野生型 D合，高温变性后，退火形成 DNA 杂交双链，进而采用 EMC 法检糖凝胶电泳图中条带数目和片段大小来判断靶序列上是否存在 1-3）。与 PCR/RE 法相比 EMC 法适用于任何靶序列，使用更为也可以在一定程度上切割非错配的同源双链 DNA[65,66]，所以检测CR / RE 法，同时也比较耗时费力[9,60]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening[J]. Yufeng Hua,Chun Wang,Jian Huang,Kejian Wang. Journal of Genetics and Genomics. 2017(04)
[2]彩叶草对模拟干旱胁迫的生理响应[J]. 刘爱荣,张远兵,张雪平,王雪娟,黄守程,谢宜勤. 广西植物. 2015(05)
[3]Heterotrimeric G protein α subunit is involved in rice brassinosteroid response[J]. Lei Wang~(1,2) Yun-Yuan Xu~1 Qi-Bin Ma~(1,2) Dan Li~(1,2) Zhi-Hong Xu~(1,3) Kang Chong~(1,3) 1 Key Laboratory of Photosynthesis and Environmental Molecular Physiology,Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences,Nanxincun 20,Xiangshan,Beijing 100093,China,2 Graduate School of the Chinese Academv of Sciences,100046 Beijing,China;3 National Plant Gene Research Center (Beijing),Beijing 100093,China. Cell Research. 2006(12)
[4]紫外分光光度技术测定植物细胞中H2O2的含量[J]. 夏金婵,苗雨晨,宋纯鹏,苗琛. 四川大学学报(自然科学版). 2005(06)
[5]花粉的保存及其生活力测定[J]. 王钦丽,卢龙斗,吴小琴,陈祖铿,林金星. 植物学通报. 2002(03)
[6]抗坏血酸过氧化物酶活性测定的探讨[J]. 沈文飚,徐朗莱,叶茂炳,张荣铣. 植物生理学通讯. 1996(03)
[7]植物胚胎学实验方法 (一)花粉生活力的测定[J]. 胡适宜. 植物学通报. 1993(02)
[8]杏果实成熟衰老过程中活性氧和几种生理指标的变化(简报)[J]. 任小林,李嘉瑞. 植物生理学通讯. 1991(01)
[9]水稻叶片叶绿素含量与株型的关系及叶位叶绿素含量的变化[J]. 沈福成. 贵州农业科学. 1986(01)
本文编号：3133359
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3133359.html
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