哺乳动物细胞CRISPR/Cas9介导精准基因编辑富集系统的构建、应用及优化研究

发布时间：2021-04-13 00:23

　　精准基因组编辑使科学家可以按照意愿直接改变基因组序列,以研究基因功能,并有利于开发出安全、高度精确的基因治疗方法。CRISPR/Cas9系统利用Cas9核酸酶与单链导向RNA（sgRNA）复合物,通过更有效地诱导基因组中特定位点的DNA双链断裂,使研究人员能够进行基因组编辑。DNA双链断裂主要由非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HDR）两种机制来修复。相比NHEJ在DNA双链断裂处进行不可预测的碱基插入或者缺失,HDR可以利用与DNA双链断裂处周围区域同源的外源性DNA为供体模板,以精确重组的方式修复DNA。精准基因组编辑技术的核心是基于基因组双链断裂后的HDR修复机制。然而,在哺乳动物细胞基因组中,HDR修复效率远远低于NHEJ修复效率,这限制了精准编辑在哺乳动物细胞中的应用。为了提高CRISPR/Cas9和HDR介导的精准编辑效率,研究人员提出了抑制NHEJ通路、激活HDR通路或者控制细胞周期等方法,均在一定程度上提高了HDR效率。另外,由于较低的HDR效率,从所有处理过的细胞群中分离出基因精确修饰的阳性细胞尤其耗时、耗力。前期研究已经开发的富集基因编辑细胞的方法主要基于筛选转... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：博士

【部分图文】：

CRISPR/Cas适应性免疫系统的工作机制

西北农林科技大学博士学位论文基础。负责编码功能蛋白的 Cas 基因被称为效应复合物。CRISPR/Cas 系统分为两类，每一类都有几个类型与亚型（Makarova et al. 2015）。第一类 CRISPR/Cas 主要来自细菌和古生菌，包含 I、III 和 IV 型；第二类只在细菌中发现，包含 II 和 V 型（Chylinski etal. 2014）。如图 1-2 所示，第二类的功能蛋白的结构相对第一类要更简单一些。II 型和V 型中功能蛋白分别由 Cas9 和 Cpf1 单个大蛋白发挥作用。目前广泛应用的 Cas9 蛋白属于 II 型。第一类的功能蛋白都为多亚基，由多个蛋白组成（Makarova et al. 2015）。Cas1和 Cas2 基因在除了 IV 型外的其它类型中都存在。不同的 Cas 蛋白在 CRISPR/Cas 系统中有不同的作用。Cas1蛋白是一种整合酶，它是通过切割Repeats区特异位点向CRISPR阵列插入新鉴定的间隔（spacer）所必需的。Cas2 蛋白的功能目前还不清楚，但是，该蛋白具有核糖核酸酶（RNase）和脱氧核糖核酸酶（DNase）活性，并用于大肠杆菌的适应阶段（Wiedenheft et al. 2009; Nunez et al. 2015）。

第一章 文献综述1.2 DNA 双链断裂的修复机制DNA 双链断裂（Double strands breaks，DSBs）严重威胁着基因组的完整性，细胞内主要有两种机制修复 DSBs：非同源末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ）和同源序列介导的同源重组（Homology-directed repair, HDR）（图 1-3）（Decottignies2013）。基因编辑技术就是通过核酸酶技术切割基因组形成双链断裂，然后通过不同的修复机制来实现碱基插入、缺失或者替换。


本文编号：3134260