携带pvl基因的金黄色葡萄球菌快速检测及其致病机制研究
发布时间：2021-04-22 21:23
研究背景:在世界范围内,金黄色葡萄球菌是引起重症肺炎和菌血症等医院内侵袭性感染的重要病原体,同时也是社区获得性感染的主要病原体之一。随着临床治疗中抗生素越来越频繁的使用,出现了大量具有多重耐药性的“超级病菌”,即耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）。MRSA在临床患者中的大量出现直接导致其治疗更为困难。近年来的研究发现,携带杀伤白细胞素（pvl）基因的MRSA菌毒力更强危害更广,可以造成严重的社区内感染,并严重危及感染者生命,由其引起的坏死性肺炎的死亡率可达75%。目前临床对于携带pvl基因的MRSA菌尚无快速鉴定方法,非常不利于感染者的及时诊断和治疗,因此建立相关快速检测技术极具临床价值。目前对于携带pvl基因的MRSA菌的致病机制仍不明晰,通过其致病机制的研究可以为临床治疗提供新的思路。研究目的:1.建立携带pvl基因的MRSA菌的快速检测技术;2.研究携带pvl基因的MRSA菌诱导巨噬细胞（THP-1细胞）自噬、凋亡和焦亡机制;3.研究携带pvl基因的MRSA菌诱导上皮细胞（A549细胞）的...
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：93 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
常用缩写词中英文对照表
第一章 绪论
1.1 耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌研究进展
1.2 杀白细胞素
1.3 LAMP
1.4 细胞自噬
1.5 细胞焦亡
1.6 细胞凋亡
1.7 核因子kappa B（NF-κB）
1.8 研究目的
1.9 研究内容
1.10 研究方法
1.11 实验设计
1.12 研究意义
第二章 建立携带pvl基因的MRSA菌快速检测方法
2.1 实验材料和试剂
2.1.1 实验耗材
2.1.2 培养基和常用试剂配制
2.1.3 实验仪器
2.1.4 引物序列
2.2 实验方法
2.2.1 碱裂解法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA
2.2.2 PCR法检测spa、mec A、femB和 pvl基因
2.2.3 LAMP法检测spa、mec A基因
2.2.4 重组LukS-PV蛋白表达纯化
2.2.5 制备LukS-PV多克隆抗体
2.2.6 Western blotting法检测PVL表达
2.2.6.1 制备蛋白沉淀
2.2.6.2 Western blotting
2.3 结果
2.3.1 PCR法检测spa、mec A、femB和 pvl基因
2.3.2 LAMP法检测spa和 mec A基因
2.3.3 LukS-PV蛋白多克隆抗体制备
2.3.3.1 LukS-PV蛋白的表达与纯化
2.3.3.2 多克隆抗体制备
2.3.3.3 Western blotting法检测PVL表达
2.4 讨论
第三章 PVL诱导THP-1 细胞和A549 细胞自噬、凋亡和焦亡的研究
3.1 实验材料和试剂
3.1.1 实验材料
3.1.1.1 菌株和细胞
3.1.1.2 实验耗材
3.1.2 试剂配制
3.1.3 实验仪器
3.1.4 引物序列
3.2 实验方法
3.2.1 PCR法检测mec A和 pvl基因
3.2.2 Western blotting法检测PVL表达
3.2.3 细菌-细胞共培养
3.2.3.1 细胞培养
3.2.3.2 金黄色葡萄球菌-细胞共培养
3.2.4 Real-time PCR法检测基因表达
3.2.4.1 提取细胞RNA并逆转录cDNA
3.2.4.2 Real-time PCR法
3.2.5 Western blotting法检测蛋白表达
3.2.5.1 提取细胞总蛋白
3.2.5.2 Western blotting
3.2.6 Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡
3.2.7 统计分析
3.3 实验结果
3.3.1 MRSA菌株mec A基因和pvl基因检测
3.3.2 Western blotting法检测细胞自噬相关蛋白的表达
3.3.2.1 THP-1 细胞LC-3和Beclin-1 蛋白的表达升高
3.3.2.2 A-549 细胞LC-3和Beclin-1 蛋白的表达无差异
3.3.3 THP-1 细胞自噬相关基因atg7和atg12 表达升高
3.3.4 Western blotting法检测Caspase-3 活化程度
3.3.4.1 THP-1 细胞Caspase-3 蛋白活化程度升高
3.3.4.2 A549 细胞Caspase-3 蛋白活化程度升高
PVL+株和MRSAPVL-株细菌诱导THP-1 细胞和A549 细胞凋亡能力"> 3.3.5 MRSAPVL+株和MRSAPVL-株细菌诱导THP-1 细胞和A549 细胞凋亡能力
3.3.5.1 THP-1细胞凋亡率升高
3.3.5.2 A549细胞凋亡率升高
3.4 讨论
第四章 金黄色葡萄球菌PVL诱导THP-1 细胞自噬、凋亡和焦亡机制研究
4.1 实验材料和试剂
4.1.1 实验材料
4.1.1.1 菌株和细胞
4.1.1.2 试剂
4.1.2 试剂配方
4.1.3 实验仪器
4.1.4 引物序列
4.2 实验方法
4.2.1 TLR-2、TLR-4 基因,NLRP3 炎症小体相关基因以及炎症因子相关基因检测
4.2.2 NF-κB信号通路活化
4.2.3 PI3K/AKT/m-TOR信号通路的活化
4.2.4 NLRP3炎症小体相关蛋白的活化
4.2.5 检测THP-1细胞活性氧表达
4.2.6 siRNA法抑制THP-1 细胞NLRP3 表达
4.2.7 Western blotting法检测转染后细胞NLRP3、GSDMD、Caspase-1、Beclin-1、LC3和Caspase-3和Cleaved Caspase-3 表达
4.3 实验结果
4.3.1 MRSA菌诱导THP-1 细胞多种细胞因子表达量升高
4.3.2 NLRP3炎症复合体相关基因的表达量升高
4.3.3 THP-1 细胞TLR-2和TLR-4 基因表达量升高
4.3.4 NF-κB信号通路的活化
4.3.5 THP-1 细胞PI3K/Akt/m-TOR信号通路的活化
4.3.6 Western blotting法检测THP-1 细胞NLRP3 炎症复合体相关蛋白表达
4.3.7 THP-1 细胞ROS表达量升高
4.3.8 转染siRNA-NLRP3后THP-1 细胞相关蛋白表达变化
4.4 讨论
第五章 金黄色葡萄球菌PVL诱导A549细胞自噬、凋亡和程序性坏死的研究
5.1 实验材料和试剂
5.1.1 实验材料
5.1.1.1 菌株和细胞
5.1.1.2 试剂
5.1.2 试剂配方
5.1.3 实验仪器
5.2 实验方法
5.2.1 细胞-细菌共培养
5.2.2 检测A549细胞活性氧的表达
5.3 实验结果
5.3.1 A549细胞ROS表达升高
5.4 讨论
第六章 总结与思考
6.1 实验总结
6.2 思考与展望
参考文献
致谢
在学期间发表的学术论文及其他科研成果
【参考文献】：
期刊论文
[1]焦亡在常见消化道疾病中的机制研究[J]. 洪坤巧,邱虎,余保平. 医学综述. 2020(05)
[2]细胞焦亡与动脉粥样硬化相关性的研究进展[J]. 李洁,李海霞,阎春生,哈小琴. 中国生物制品学杂志. 2020(02)
[3]Autophagy and inflammation in ischemic stroke[J]. Yun Mo,Yin-Yi Sun,Kang-Yong Liu. Neural Regeneration Research. 2020(08)
[4]Resatorvid protects against hypoxic-ischemic brain damage in neonatal rats[J]. Li-Jun Jiang,Zhen-Xing Xu,Ming-Fu Wu,Gai-Qin Dong,Li-Li Zhang,Jun-Yan Gao,Chen-Xi Feng,Xing Feng. Neural Regeneration Research. 2020(07)
[5]Cloning,expression pattern,and potential role of MAPKp38 and NF-κBp65 in response to lipopolysaccharide in yellow catfish（Pelteobagrus fulvidraco）[J]. Dan Shi,Ye Zhao,Lin Feng,Yang Liu,Wei-Dan Jiang,Pei Wu,Juan Zhao,Jun Jiang,Xiao-Qiu Zhou. Animal Nutrition. 2019(04)
[6]铜绿假单胞菌LAMP快速检测方法建立及微滴数字PCR验证[J]. 李羽翡,祖新,李羽翠,张德荣. 食品工业科技. 2020(11)
[7]活性氧在GDC-0152诱导NB4细胞凋亡和自噬中的作用[J]. 李川,姜薇,刘卓刚,梁佩淇,胡荣. 中国实验血液学杂志. 2019(06)
[8]Therapeutic effect of regulating autophagy in spinal cord injury: a network meta-analysis of direct and indirect comparisons[J]. Duo Zhang,Di Zhu,Fang Wang,Ji-Chao Zhu,Xu Zhai,Yuan Yuan,Chen-Xi Li. Neural Regeneration Research. 2020(06)
[9]金黄色葡萄球菌PV-杀白细胞素的表达及其对奶牛乳腺上皮细胞的损伤作用[J]. 马维武,周学章. 畜牧兽医学报. 2019(10)
[10]一例犬耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的诊断[J]. 李晔,赵景利,刘华勇. 兽医导刊. 2019(19)
本文编号：3154492
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：93 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
常用缩写词中英文对照表
第一章 绪论
1.1 耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌研究进展
1.2 杀白细胞素
1.3 LAMP
1.4 细胞自噬
1.5 细胞焦亡
1.6 细胞凋亡
1.7 核因子kappa B（NF-κB）
1.8 研究目的
1.9 研究内容
1.10 研究方法
1.11 实验设计
1.12 研究意义
第二章 建立携带pvl基因的MRSA菌快速检测方法
2.1 实验材料和试剂
2.1.1 实验耗材
2.1.2 培养基和常用试剂配制
2.1.3 实验仪器
2.1.4 引物序列
2.2 实验方法
2.2.1 碱裂解法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA
2.2.2 PCR法检测spa、mec A、femB和 pvl基因
2.2.3 LAMP法检测spa、mec A基因
2.2.4 重组LukS-PV蛋白表达纯化
2.2.5 制备LukS-PV多克隆抗体
2.2.6 Western blotting法检测PVL表达
2.2.6.1 制备蛋白沉淀
2.2.6.2 Western blotting
2.3 结果
2.3.1 PCR法检测spa、mec A、femB和 pvl基因
2.3.2 LAMP法检测spa和 mec A基因
2.3.3 LukS-PV蛋白多克隆抗体制备
2.3.3.1 LukS-PV蛋白的表达与纯化
2.3.3.2 多克隆抗体制备
2.3.3.3 Western blotting法检测PVL表达
2.4 讨论
第三章 PVL诱导THP-1 细胞和A549 细胞自噬、凋亡和焦亡的研究
3.1 实验材料和试剂
3.1.1 实验材料
3.1.1.1 菌株和细胞
3.1.1.2 实验耗材
3.1.2 试剂配制
3.1.3 实验仪器
3.1.4 引物序列
3.2 实验方法
3.2.1 PCR法检测mec A和 pvl基因
3.2.2 Western blotting法检测PVL表达
3.2.3 细菌-细胞共培养
3.2.3.1 细胞培养
3.2.3.2 金黄色葡萄球菌-细胞共培养
3.2.4 Real-time PCR法检测基因表达
3.2.4.1 提取细胞RNA并逆转录cDNA
3.2.4.2 Real-time PCR法
3.2.5 Western blotting法检测蛋白表达
3.2.5.1 提取细胞总蛋白
3.2.5.2 Western blotting
3.2.6 Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡
3.2.7 统计分析
3.3 实验结果
3.3.1 MRSA菌株mec A基因和pvl基因检测
3.3.2 Western blotting法检测细胞自噬相关蛋白的表达
3.3.2.1 THP-1 细胞LC-3和Beclin-1 蛋白的表达升高
3.3.2.2 A-549 细胞LC-3和Beclin-1 蛋白的表达无差异
3.3.3 THP-1 细胞自噬相关基因atg7和atg12 表达升高
3.3.4 Western blotting法检测Caspase-3 活化程度
3.3.4.1 THP-1 细胞Caspase-3 蛋白活化程度升高
3.3.4.2 A549 细胞Caspase-3 蛋白活化程度升高
PVL+株和MRSAPVL-株细菌诱导THP-1 细胞和A549 细胞凋亡能力"> 3.3.5 MRSAPVL+株和MRSAPVL-株细菌诱导THP-1 细胞和A549 细胞凋亡能力
3.3.5.1 THP-1细胞凋亡率升高
3.3.5.2 A549细胞凋亡率升高
3.4 讨论
第四章 金黄色葡萄球菌PVL诱导THP-1 细胞自噬、凋亡和焦亡机制研究
4.1 实验材料和试剂
4.1.1 实验材料
4.1.1.1 菌株和细胞
4.1.1.2 试剂
4.1.2 试剂配方
4.1.3 实验仪器
4.1.4 引物序列
4.2 实验方法
4.2.1 TLR-2、TLR-4 基因,NLRP3 炎症小体相关基因以及炎症因子相关基因检测
4.2.2 NF-κB信号通路活化
4.2.3 PI3K/AKT/m-TOR信号通路的活化
4.2.4 NLRP3炎症小体相关蛋白的活化
4.2.5 检测THP-1细胞活性氧表达
4.2.6 siRNA法抑制THP-1 细胞NLRP3 表达
4.2.7 Western blotting法检测转染后细胞NLRP3、GSDMD、Caspase-1、Beclin-1、LC3和Caspase-3和Cleaved Caspase-3 表达
4.3 实验结果
4.3.1 MRSA菌诱导THP-1 细胞多种细胞因子表达量升高
4.3.2 NLRP3炎症复合体相关基因的表达量升高
4.3.3 THP-1 细胞TLR-2和TLR-4 基因表达量升高
4.3.4 NF-κB信号通路的活化
4.3.5 THP-1 细胞PI3K/Akt/m-TOR信号通路的活化
4.3.6 Western blotting法检测THP-1 细胞NLRP3 炎症复合体相关蛋白表达
4.3.7 THP-1 细胞ROS表达量升高
4.3.8 转染siRNA-NLRP3后THP-1 细胞相关蛋白表达变化
4.4 讨论
第五章 金黄色葡萄球菌PVL诱导A549细胞自噬、凋亡和程序性坏死的研究
5.1 实验材料和试剂
5.1.1 实验材料
5.1.1.1 菌株和细胞
5.1.1.2 试剂
5.1.2 试剂配方
5.1.3 实验仪器
5.2 实验方法
5.2.1 细胞-细菌共培养
5.2.2 检测A549细胞活性氧的表达
5.3 实验结果
5.3.1 A549细胞ROS表达升高
5.4 讨论
第六章 总结与思考
6.1 实验总结
6.2 思考与展望
参考文献
致谢
在学期间发表的学术论文及其他科研成果
【参考文献】：
期刊论文
[1]焦亡在常见消化道疾病中的机制研究[J]. 洪坤巧,邱虎,余保平. 医学综述. 2020(05)
[2]细胞焦亡与动脉粥样硬化相关性的研究进展[J]. 李洁,李海霞,阎春生,哈小琴. 中国生物制品学杂志. 2020(02)
[3]Autophagy and inflammation in ischemic stroke[J]. Yun Mo,Yin-Yi Sun,Kang-Yong Liu. Neural Regeneration Research. 2020(08)
[4]Resatorvid protects against hypoxic-ischemic brain damage in neonatal rats[J]. Li-Jun Jiang,Zhen-Xing Xu,Ming-Fu Wu,Gai-Qin Dong,Li-Li Zhang,Jun-Yan Gao,Chen-Xi Feng,Xing Feng. Neural Regeneration Research. 2020(07)
[5]Cloning,expression pattern,and potential role of MAPKp38 and NF-κBp65 in response to lipopolysaccharide in yellow catfish（Pelteobagrus fulvidraco）[J]. Dan Shi,Ye Zhao,Lin Feng,Yang Liu,Wei-Dan Jiang,Pei Wu,Juan Zhao,Jun Jiang,Xiao-Qiu Zhou. Animal Nutrition. 2019(04)
[6]铜绿假单胞菌LAMP快速检测方法建立及微滴数字PCR验证[J]. 李羽翡,祖新,李羽翠,张德荣. 食品工业科技. 2020(11)
[7]活性氧在GDC-0152诱导NB4细胞凋亡和自噬中的作用[J]. 李川,姜薇,刘卓刚,梁佩淇,胡荣. 中国实验血液学杂志. 2019(06)
[8]Therapeutic effect of regulating autophagy in spinal cord injury: a network meta-analysis of direct and indirect comparisons[J]. Duo Zhang,Di Zhu,Fang Wang,Ji-Chao Zhu,Xu Zhai,Yuan Yuan,Chen-Xi Li. Neural Regeneration Research. 2020(06)
[9]金黄色葡萄球菌PV-杀白细胞素的表达及其对奶牛乳腺上皮细胞的损伤作用[J]. 马维武,周学章. 畜牧兽医学报. 2019(10)
[10]一例犬耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的诊断[J]. 李晔,赵景利,刘华勇. 兽医导刊. 2019(19)
本文编号：3154492
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3154492.html
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