cAMP相关基因在嗜热毁丝霉纤维素酶基因表达调控中的作用
发布时间：2021-04-24 11:43
木质纤维素是规模最大、分布范围最广、含量最丰富的一类可再生资源。微生物产生的纤维素酶降解纤维素产生的葡萄糖,可进一步被转化为乙醇等其它能源物质可以缓解目前的能源压力。嗜热毁丝霉能够产生热稳定性的纤维素酶,被称为潜在的高效中高温酶库。环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）是细胞内参与调节物质代谢和生物学功能的重要物质,是生物体内重要的第二信使。它能够降低真菌的碳代谢阻遏效应从而提高真菌产纤维素酶的能力,而腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶可共同调节细胞内的cAMP水平。本研究主要利用RNAi技术干扰嗜热毁丝霉的腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶基因的表达,及使用外源添加cAMP的方法,从多角度来研究cAMP及相关基因在嗜热毁丝霉基因表达调控中的作用。本论文的主要内容如下:1)干扰腺苷酸环化酶基因方面:腺苷酸环化酶是细胞响应外界环境信号、调节胞内cAMP水平的关键酶,同时也是能够催化ATP形成cAMP的唯一酶。本研究针对嗜热毁丝霉腺苷酸环化酶ac基因设计干扰序列,利用pUC19-MtPpdc-MtTpdc质粒构建重组干扰表达载体。将干扰表达载体和pAN7-1质粒共...
【文章来源】：深圳大学广东省
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
1.纤维素酶概述
2.嗜热毁丝霉概述
3.cAMP在真菌产酶中的研究概况
3.1 cAMP概述
3.2 cAMP在真菌产酶中的研究进展
4.碳代谢阻遏效应
5.RNA干扰技术在真菌中的应用
6.iTRAQ技术
7.本文的主要研究内容和意义
第2章 RNA干扰嗜热毁丝霉腺苷酸环化酶基因对纤维素酶活性的影响
1.实验材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株与质粒
1.1.2 培养基与试剂
1.1.3 相关仪器和设备
1.1.4 寡核苷酸引物
1.2 实验方法
1.2.1 腺苷酸环化酶基因ac的 siRNA寡核苷酸片段的设计及合成
1.2.2 siRNA寡核苷酸片段退火
1.2.3 质粒提取及酶切
1.2.4 腺苷酸环化酶基因干扰表达载体构建
1.2.5 嗜热毁丝霉原生质体制备与转化
1.2.6 转化子基因组DNA提取及验证
1.2.7 嗜热毁丝霉总RNA提取
1.2.8 RT-qPCR
1.3 纤维素酶活性的测定
1.3.1 FPA酶活的测定
1.3.2 CMC酶活的测定
1.3.3 BG酶活的测定
2.实验结果与分析
2.1 ac干扰序列的设计及重组载体的构建
2.2 嗜热毁丝霉原生质体转化及阳性转化子的筛选鉴定
2.3 ac基因的荧光定量分析
2.4 纤维素酶活的测定
2.5 主要纤维素酶基因的荧光定量分析
2.6 磷酸二酯酶基因的荧光定量分析
3.讨论
4.小结
第3章 外源添加cAMP对嗜热毁丝霉纤维素酶活性的影响
1.实验材料
1.1 菌株
1.2 培养基与试剂
1.3 相关仪器
2.实验方法
2.1 cAMP试剂的配制
2.2 外源添加cAMP
2.3 嗜热毁丝霉孢子悬浮液的制备
2.4 纤维素酶活性的测定
2.4.1 FPA酶活的测定
2.4.2 CMC酶活的测定
2.4.3 BG酶活的测定
2.5 主要纤维素酶基因表达量的荧光定量分析
2.6 嗜热毁丝霉蛋白质的提取
2.7 iTRAQ操作步骤
3.实验结果与分析
3.1 纤维素酶活性的测定结果
3.2 主要纤维素酶基因表达量的荧光定量分析
3.3 腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶基因的荧光定量分析
3.4 iTRAQ结果分析
3.4.1 差异蛋白的生物学过程的分析
3.4.2 差异蛋白的细胞成分的分析
3.4.3 差异蛋白的分子功能的分析
3.4.4 差异蛋白基因的Pathway富集分析
4.讨论
5.小结
第4章 RNA干扰pde基因对嗜热毁丝霉纤维素酶活性的影响
1.实验材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株与质粒
1.1.2 培养基与试剂
1.1.3 相关仪器
1.1.4 寡核苷酸引物
1.2 实验方法
1.2.1 pde基因siRNA寡核苷酸片段的设计及合成
1.2.2 siRNA寡核苷酸片段的退火
1.2.3 质粒的提取及酶切
1.2.4 pde siRNA寡核苷酸片段干扰表达载体的构建
1.2.5 嗜热毁丝霉原生质体的制备与转化
1.2.6 转化子基因组DNA的提取及验证
1.2.7 嗜热毁丝霉总RNA的提取
1.2.8 RT-qPCR
1.3 纤维素酶活性的测定
1.3.1 FPA酶活的测定
1.3.2 CMC酶活的测定
1.3.3 BG酶活的测定
1.4 主要纤维素酶相关基因表达量的荧光定量分析
2.实验结果与分析
2.1 pde基因干扰序列的设计及重组载体的构建
2.2 嗜热毁丝霉原生质体转化及阳性转化子的筛选
2.3 pde基因的荧光定量分析
2.4 酶活的测定
2.5 主要纤维素酶基因的荧光定量分析
2.6 腺苷酸环化酶基因的荧光定量分析
3.讨论
4.小结
第5章 结论
参考文献
附录
致谢
攻读硕士学位期间的研究成果
本文编号：3157299
【文章来源】：深圳大学广东省
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
1.纤维素酶概述
2.嗜热毁丝霉概述
3.cAMP在真菌产酶中的研究概况
3.1 cAMP概述
3.2 cAMP在真菌产酶中的研究进展
4.碳代谢阻遏效应
5.RNA干扰技术在真菌中的应用
6.iTRAQ技术
7.本文的主要研究内容和意义
第2章 RNA干扰嗜热毁丝霉腺苷酸环化酶基因对纤维素酶活性的影响
1.实验材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株与质粒
1.1.2 培养基与试剂
1.1.3 相关仪器和设备
1.1.4 寡核苷酸引物
1.2 实验方法
1.2.1 腺苷酸环化酶基因ac的 siRNA寡核苷酸片段的设计及合成
1.2.2 siRNA寡核苷酸片段退火
1.2.3 质粒提取及酶切
1.2.4 腺苷酸环化酶基因干扰表达载体构建
1.2.5 嗜热毁丝霉原生质体制备与转化
1.2.6 转化子基因组DNA提取及验证
1.2.7 嗜热毁丝霉总RNA提取
1.2.8 RT-qPCR
1.3 纤维素酶活性的测定
1.3.1 FPA酶活的测定
1.3.2 CMC酶活的测定
1.3.3 BG酶活的测定
2.实验结果与分析
2.1 ac干扰序列的设计及重组载体的构建
2.2 嗜热毁丝霉原生质体转化及阳性转化子的筛选鉴定
2.3 ac基因的荧光定量分析
2.4 纤维素酶活的测定
2.5 主要纤维素酶基因的荧光定量分析
2.6 磷酸二酯酶基因的荧光定量分析
3.讨论
4.小结
第3章 外源添加cAMP对嗜热毁丝霉纤维素酶活性的影响
1.实验材料
1.1 菌株
1.2 培养基与试剂
1.3 相关仪器
2.实验方法
2.1 cAMP试剂的配制
2.2 外源添加cAMP
2.3 嗜热毁丝霉孢子悬浮液的制备
2.4 纤维素酶活性的测定
2.4.1 FPA酶活的测定
2.4.2 CMC酶活的测定
2.4.3 BG酶活的测定
2.5 主要纤维素酶基因表达量的荧光定量分析
2.6 嗜热毁丝霉蛋白质的提取
2.7 iTRAQ操作步骤
3.实验结果与分析
3.1 纤维素酶活性的测定结果
3.2 主要纤维素酶基因表达量的荧光定量分析
3.3 腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶基因的荧光定量分析
3.4 iTRAQ结果分析
3.4.1 差异蛋白的生物学过程的分析
3.4.2 差异蛋白的细胞成分的分析
3.4.3 差异蛋白的分子功能的分析
3.4.4 差异蛋白基因的Pathway富集分析
4.讨论
5.小结
第4章 RNA干扰pde基因对嗜热毁丝霉纤维素酶活性的影响
1.实验材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株与质粒
1.1.2 培养基与试剂
1.1.3 相关仪器
1.1.4 寡核苷酸引物
1.2 实验方法
1.2.1 pde基因siRNA寡核苷酸片段的设计及合成
1.2.2 siRNA寡核苷酸片段的退火
1.2.3 质粒的提取及酶切
1.2.4 pde siRNA寡核苷酸片段干扰表达载体的构建
1.2.5 嗜热毁丝霉原生质体的制备与转化
1.2.6 转化子基因组DNA的提取及验证
1.2.7 嗜热毁丝霉总RNA的提取
1.2.8 RT-qPCR
1.3 纤维素酶活性的测定
1.3.1 FPA酶活的测定
1.3.2 CMC酶活的测定
1.3.3 BG酶活的测定
1.4 主要纤维素酶相关基因表达量的荧光定量分析
2.实验结果与分析
2.1 pde基因干扰序列的设计及重组载体的构建
2.2 嗜热毁丝霉原生质体转化及阳性转化子的筛选
2.3 pde基因的荧光定量分析
2.4 酶活的测定
2.5 主要纤维素酶基因的荧光定量分析
2.6 腺苷酸环化酶基因的荧光定量分析
3.讨论
4.小结
第5章 结论
参考文献
附录
致谢
攻读硕士学位期间的研究成果
本文编号：3157299
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3157299.html
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