StCYS1基因对马铃薯酶促褐变及耐盐的影响
发布时间：2021-06-23 03:08
蛋白酶抑制子（proteinase inhibitors,PIs）广泛存在于动植物及微生物中。半胱氨酸蛋白酶抑制子（Cystatin,CYS）主要参与植物种子的萌发、植物生长发育、细胞程序化死亡以及植物对生物、非生物胁迫的应答。马铃薯（Solanum tuberosum L.）CYS是存在于其块茎和植株中的小分子量可溶性蛋白,目前它的研究多集中于对马铃薯胁迫的响应和调控方面。实验室前期通过RNA-Seq分析发现,CYS可能参与调控鲜切马铃薯的酶促褐变,但尚未得到转基因功能验证;CYS在大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）中表达能够提高菌的抗盐能力。本实验利用超表达CYS基因StCYS1的二倍体马铃薯“MDS”,验证其抑制褐变和抗盐的效果,并探究其抑制块茎褐变和提高植株耐盐性的机理。研究还以四倍体马铃薯“Desiree”为材料,应用CRISPR/Cas9技术成功构建了StCYS1的基因编辑载体,拟通过获得马铃薯StCYS1突变体植株,探究是否具有增强褐变的表征,旨在为后续进一步研究奠定基础。主要研究结果如下:（1）超表达StCYS1对二倍体马铃薯块茎酶促褐变的影响。...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
超表达StCYS1和野生型二倍体马铃薯株系块茎表型Fig.1ThetuberphenotypesofStCYS1overexpressedandwild-typediploidpotatolines
山东农业大学硕士学位论文253.1.2超表达StCYS1对马铃薯块茎StCYS1基因表达量与浆液褐变的影响图2超表达StCYS1基因对马铃薯块茎中基因表达量及浆液褐变的影响（A）WT、OE1-3马铃薯块茎StCYS1基因表达量；（B）WT、OE1-3马铃薯块茎浆液褐变差异。图中不同字母代表差异性显著（P<0.05），下同。Fig.2EffectsofoverexpressionofStCYS1geneongeneexpressionandserousBrowninginpotatotubers(A)theStCYS1geneexpressionofWTandOE1-3potatotubers,(B)differencesintuberserousbrowningofWTandOE1-3potatoes.Differentlettersinthefigurerepresentsignificantdifferences(P<0.05),thesameasbelow.图2A是三个超表达StCYS1的二倍体马铃薯株系OE1-OE3和野生型WT（MDS）马铃薯块茎中基因表达量测定结果。OE1-OE3的StCYS1表达量分别是WT的5.21倍、5.67倍和4.17倍，超表达三个株系的基因表达量均显著高于WT（P<0.05），其中三个超表达株系中，OE1和OE2株系表达量较高，而OE3表达量最低。OE1-OE3和WT结薯后，挑选大小相当、无破损的马铃薯块茎去皮、液氮研磨成粉加水后观察其浆液褐变情况。如图1B所示，随时间变化，WT浆液褐变程度逐渐加重，而超表达StCYS1的三个株系OE1-OE3浆液褐变程度均显著低于WT，且三个株系中，表达量较高的两个株系OE1、OE2褐变程度一直低于OE3。结果表明超表达StCYS1可显著抑制马铃薯浆液的褐变。在此基础上，我们通过测定WT和超表达株系块茎PPO活性、抗氧化能力及游离氨基酸含量，来探讨超表达StCYS1对马铃薯块茎褐变的影响机制。
StCYS1基因对马铃薯酶促褐变及耐盐的影响263.1.3超表达StCYS1对马铃薯块茎PPO活性和抗氧化能力的影响图3超表达StCYS1对马铃薯块茎PPO活性的影响Fig.3EffectofoverexpressionofStCYS1onPPOactivityinpotatotuberPPO在有氧条件下的酶促褐变往往是导致鲜切加工果蔬褐变的主要原因（Gonzálezetal.,2020）。而诸多研究通过正义、反义RNA或microRNAs技术来抑制马铃薯PPO基因表达，以及通过物理、化学、生物的方法抑制PPO活性，均可降低马铃薯块茎鲜切褐变（Chietal.,2014；张凯等，2017）。那么超表达StCYS1对马铃薯块茎的PPO活性会产生怎样的影响呢？结果如图3所示，OE1和OE2酶活性分别是WT的1.41和1.36倍，均显著高于WT(P<0.05），OE3酶活性是WT的1.08倍，并无显著性差异。结合图2可知，超表达StCYS1的三个马铃薯株系OE1-3，其块茎浆液褐变程度均显著低于野生型，但其中OE1和OE2马铃薯块茎中PPO活性显著高于野生型，OE3和WT无显著差异，综合图2、图3结果表明，超表达StCYS1的马铃薯块茎褐变程度显著降低，PPO活性的变化可能并不是关键因素，还存在其他能够抑制褐变的要素。有研究表明，PIs的积累能够提高马铃薯的抗氧化能力（Leeetal.,2016），而有关马铃薯鲜切褐变控制的研究中发现，块茎抗氧化能力，如DPPH自由基清除率、FRAP和ABTS自由基清除率等的提高，往往会抑制鲜切褐变（范昊安等，2019；刘博文，2017），因此我们测定了WT和超表达株系的抗氧化能力，如图4A所示，超表达株系的FRAP（铁还原能力）、DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率均显著高于野生型WT（P<0.05）。综合比较图4A-C结果表明，不同指标的测定结果具有一致性，三者互为印证，即StCYS1基因的超表达显著提高了马铃薯块茎的抗氧化能力。
【参考文献】：
期刊论文
[1]二倍体马铃薯基因编辑载体快速验证体系的建立[J]. 蒋继滨,高冬丽,朱曦鉴,李灿辉. 种子. 2019(10)
[2]苹果梨酵素发酵过程中的褐变与抗氧化活性[J]. 范昊安,沙如意,方晟,薛淑龙,陈雨,黄俊,崔艳丽,毛建卫. 食品科学. 2020(14)
[3]贵州不同种类茶叶的几种抗氧化成分及其抗氧化能力分析[J]. 罗冬兰,黎晓燕,曹森,巴良杰. 食品研究与开发. 2019(17)
[4]外源H2O2对盐胁迫下黄瓜幼苗氧化胁迫及抗氧化系统的影响[J]. 蒋景龙,沈季雪,李丽. 西北农业学报. 2019(06)
[5]蛋白酶抑制子在植物与病原物互作中的作用[J]. 王长春,刘真真,叶涛,刘敏,韩佳峰,吴园园,杨玲. 浙江师范大学学报(自然科学版). 2019(02)
[6]无义突变与“遗传补偿效应”[J]. 马志鹏,陈军. 遗传. 2019(05)
[7]CRISPR/Cas9系统在植物基因功能研究中的应用进展[J]. 霍晋彦,李姣,荆雅峰,冯宝民,于宗霞. 植物生理学报. 2019(03)
[8]CRISPR/Cas9基因编辑技术在果蔬作物中的应用[J]. 舒攀,崔席席,李富军,闵德栋,张新华,董路路,任春涛. 植物生理学报. 2019(02)
[9]甘薯半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因（CPI）克隆及功能初步分析[J]. 洪子茜,杨秋萍,侯馨怡,邓鸽,张立,费雪婷,胡又文,雍彬,邵欢欢. 新农业. 2018(15)
[10]CRISPR/Cas9介导的植物基因编辑技术研究进展[J]. 时欢,林玉玲,赖钟雄,杜宜殷,黄鹏林. 应用与环境生物学报. 2018(03)
硕士论文
[1]CRISPR/Cpf1技术编辑二倍体马铃薯基因组的研究[D]. 蒋继滨.云南师范大学 2019
[2]利用CRISPR/Cas9技术选育马铃薯低龙葵素、抗低温糖化和支链淀粉高的新品系[D]. 赵国超.内蒙古大学 2019
[3]天冬氨酸抑制鲜切马铃薯褐变的研究[D]. 刘箕箕.山东农业大学 2019
[4]短时回温抑制鲜切马铃薯褐变机理的研究[D]. 徐鑫.山东农业大学 2019
[5]马铃薯StCPI基因的分子克隆、表达纯化及抗逆功能表征[D]. 李亚伦.山东农业大学 2018
[6]应用基因编辑技术抑制马铃薯多酚氧化酶的研究[D]. 陈明俊.贵州大学 2018
[7]应用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得高直链淀粉马铃薯[D]. 潘京.内蒙古大学 2017
[8]预切伤抑制鲜切马铃薯褐变技术及机理的初步研究[D]. 刘博文.山东农业大学 2017
[9]鲜切马铃薯褐变机理的研究[D]. 曹裕.山东农业大学 2016
[10]野生种马铃薯抗虫相关蛋白酶抑制剂基因SpCYS的功能分析[D]. 白潇.南京农业大学 2014
本文编号：3244104
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
超表达StCYS1和野生型二倍体马铃薯株系块茎表型Fig.1ThetuberphenotypesofStCYS1overexpressedandwild-typediploidpotatolines
山东农业大学硕士学位论文253.1.2超表达StCYS1对马铃薯块茎StCYS1基因表达量与浆液褐变的影响图2超表达StCYS1基因对马铃薯块茎中基因表达量及浆液褐变的影响（A）WT、OE1-3马铃薯块茎StCYS1基因表达量；（B）WT、OE1-3马铃薯块茎浆液褐变差异。图中不同字母代表差异性显著（P<0.05），下同。Fig.2EffectsofoverexpressionofStCYS1geneongeneexpressionandserousBrowninginpotatotubers(A)theStCYS1geneexpressionofWTandOE1-3potatotubers,(B)differencesintuberserousbrowningofWTandOE1-3potatoes.Differentlettersinthefigurerepresentsignificantdifferences(P<0.05),thesameasbelow.图2A是三个超表达StCYS1的二倍体马铃薯株系OE1-OE3和野生型WT（MDS）马铃薯块茎中基因表达量测定结果。OE1-OE3的StCYS1表达量分别是WT的5.21倍、5.67倍和4.17倍，超表达三个株系的基因表达量均显著高于WT（P<0.05），其中三个超表达株系中，OE1和OE2株系表达量较高，而OE3表达量最低。OE1-OE3和WT结薯后，挑选大小相当、无破损的马铃薯块茎去皮、液氮研磨成粉加水后观察其浆液褐变情况。如图1B所示，随时间变化，WT浆液褐变程度逐渐加重，而超表达StCYS1的三个株系OE1-OE3浆液褐变程度均显著低于WT，且三个株系中，表达量较高的两个株系OE1、OE2褐变程度一直低于OE3。结果表明超表达StCYS1可显著抑制马铃薯浆液的褐变。在此基础上，我们通过测定WT和超表达株系块茎PPO活性、抗氧化能力及游离氨基酸含量，来探讨超表达StCYS1对马铃薯块茎褐变的影响机制。
StCYS1基因对马铃薯酶促褐变及耐盐的影响263.1.3超表达StCYS1对马铃薯块茎PPO活性和抗氧化能力的影响图3超表达StCYS1对马铃薯块茎PPO活性的影响Fig.3EffectofoverexpressionofStCYS1onPPOactivityinpotatotuberPPO在有氧条件下的酶促褐变往往是导致鲜切加工果蔬褐变的主要原因（Gonzálezetal.,2020）。而诸多研究通过正义、反义RNA或microRNAs技术来抑制马铃薯PPO基因表达，以及通过物理、化学、生物的方法抑制PPO活性，均可降低马铃薯块茎鲜切褐变（Chietal.,2014；张凯等，2017）。那么超表达StCYS1对马铃薯块茎的PPO活性会产生怎样的影响呢？结果如图3所示，OE1和OE2酶活性分别是WT的1.41和1.36倍，均显著高于WT(P<0.05），OE3酶活性是WT的1.08倍，并无显著性差异。结合图2可知，超表达StCYS1的三个马铃薯株系OE1-3，其块茎浆液褐变程度均显著低于野生型，但其中OE1和OE2马铃薯块茎中PPO活性显著高于野生型，OE3和WT无显著差异，综合图2、图3结果表明，超表达StCYS1的马铃薯块茎褐变程度显著降低，PPO活性的变化可能并不是关键因素，还存在其他能够抑制褐变的要素。有研究表明，PIs的积累能够提高马铃薯的抗氧化能力（Leeetal.,2016），而有关马铃薯鲜切褐变控制的研究中发现，块茎抗氧化能力，如DPPH自由基清除率、FRAP和ABTS自由基清除率等的提高，往往会抑制鲜切褐变（范昊安等，2019；刘博文，2017），因此我们测定了WT和超表达株系的抗氧化能力，如图4A所示，超表达株系的FRAP（铁还原能力）、DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率均显著高于野生型WT（P<0.05）。综合比较图4A-C结果表明，不同指标的测定结果具有一致性，三者互为印证，即StCYS1基因的超表达显著提高了马铃薯块茎的抗氧化能力。
【参考文献】：
期刊论文
[1]二倍体马铃薯基因编辑载体快速验证体系的建立[J]. 蒋继滨,高冬丽,朱曦鉴,李灿辉. 种子. 2019(10)
[2]苹果梨酵素发酵过程中的褐变与抗氧化活性[J]. 范昊安,沙如意,方晟,薛淑龙,陈雨,黄俊,崔艳丽,毛建卫. 食品科学. 2020(14)
[3]贵州不同种类茶叶的几种抗氧化成分及其抗氧化能力分析[J]. 罗冬兰,黎晓燕,曹森,巴良杰. 食品研究与开发. 2019(17)
[4]外源H2O2对盐胁迫下黄瓜幼苗氧化胁迫及抗氧化系统的影响[J]. 蒋景龙,沈季雪,李丽. 西北农业学报. 2019(06)
[5]蛋白酶抑制子在植物与病原物互作中的作用[J]. 王长春,刘真真,叶涛,刘敏,韩佳峰,吴园园,杨玲. 浙江师范大学学报(自然科学版). 2019(02)
[6]无义突变与“遗传补偿效应”[J]. 马志鹏,陈军. 遗传. 2019(05)
[7]CRISPR/Cas9系统在植物基因功能研究中的应用进展[J]. 霍晋彦,李姣,荆雅峰,冯宝民,于宗霞. 植物生理学报. 2019(03)
[8]CRISPR/Cas9基因编辑技术在果蔬作物中的应用[J]. 舒攀,崔席席,李富军,闵德栋,张新华,董路路,任春涛. 植物生理学报. 2019(02)
[9]甘薯半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因（CPI）克隆及功能初步分析[J]. 洪子茜,杨秋萍,侯馨怡,邓鸽,张立,费雪婷,胡又文,雍彬,邵欢欢. 新农业. 2018(15)
[10]CRISPR/Cas9介导的植物基因编辑技术研究进展[J]. 时欢,林玉玲,赖钟雄,杜宜殷,黄鹏林. 应用与环境生物学报. 2018(03)
硕士论文
[1]CRISPR/Cpf1技术编辑二倍体马铃薯基因组的研究[D]. 蒋继滨.云南师范大学 2019
[2]利用CRISPR/Cas9技术选育马铃薯低龙葵素、抗低温糖化和支链淀粉高的新品系[D]. 赵国超.内蒙古大学 2019
[3]天冬氨酸抑制鲜切马铃薯褐变的研究[D]. 刘箕箕.山东农业大学 2019
[4]短时回温抑制鲜切马铃薯褐变机理的研究[D]. 徐鑫.山东农业大学 2019
[5]马铃薯StCPI基因的分子克隆、表达纯化及抗逆功能表征[D]. 李亚伦.山东农业大学 2018
[6]应用基因编辑技术抑制马铃薯多酚氧化酶的研究[D]. 陈明俊.贵州大学 2018
[7]应用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得高直链淀粉马铃薯[D]. 潘京.内蒙古大学 2017
[8]预切伤抑制鲜切马铃薯褐变技术及机理的初步研究[D]. 刘博文.山东农业大学 2017
[9]鲜切马铃薯褐变机理的研究[D]. 曹裕.山东农业大学 2016
[10]野生种马铃薯抗虫相关蛋白酶抑制剂基因SpCYS的功能分析[D]. 白潇.南京农业大学 2014
本文编号：3244104
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