组蛋白甲基转移酶KMT2D调控心肌细胞中HIF-1α下游基因转录的研究
发布时间：2021-07-09 06:05
背景:组蛋白甲基转移酶Histone-lysine N-methyltransferase 2D（KMT2D）是主要的组蛋白3第4位赖氨酸（Histone 3 lysine4,H3K4）甲基转移酶,在组织中广泛表达,并且在调控胚胎发育、分化和代谢过程中发挥关键作用。H3K4的甲基化（methylation）作为组蛋白修饰的一种类型,通过结合在基因的增强子与启动子区域激活基因转录。前期研究报道在小鼠胚胎期敲除Kmt2d基因会导致小鼠心脏发育不全而死亡。我们团队的研究发现,在成年小鼠心脏中特异性敲除Kmt2d,进行心梗手术后梗死面积与对照组相比明显增加,血管再生能力下降。低氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor 1,HIF-1α）是调控细胞应对低氧状态的关键转录因子,在心肌缺血缺氧条件下,HIF-1α表达上调,从而调节下游相关基因的表达,以减少心肌受损。此外,HIF-1α调控其下游基因表达存在一定的选择性,即在不同生理病理条件下对基因有不同程度的调控。有研究表明,表观遗传修饰在基因的转录调控过程中发挥重要作用,包括组蛋白甲基化、乙酰化等对HIF-1α的稳定性和转...
【文章来源】：南京中医药大学江苏省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１心肌缺血２４?ｈ后，ｍｌｌＷ组和ｍｌｌ４－ｃＫＯ组小鼠心肌组织染色??
?第二部分实验结果???平，并且观察蛋白表达水平与低氧时间点的关系。因这些蛋白都表达在细胞核内，提取核??蛋白，取１０?｜！ｇ进行Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测。ＫＭＴ２Ｄ蛋白分子量较大，经过探索采取浓度??为６％的分离胶进行电泳，ＫＭＴ２Ｄ抗体目前市面上未销售，有戈凯教授实验室赠送。首先??对其抗体特异性进行检测，结果（图１－３）显示，ＫＭＴ２Ｄ抗体可用于后续实验。结果如（图??１－４）所示：组蛋白ＨｉｓｔｏｎｅＨ３作为细胞核内参蛋白，在不同时间点表达量一致；与常氧组??（Ｏｈ）相比，ＨＩＦ－ｌａ在低氧处理后蛋白量积累，低氧４ｈ时蛋白积累量升高，８ｈ后蛋白积??累量达到最多，１６ｈ蛋白水平积累下降（图１－４Ａ）；?Ｐ３００作为ＨＩＦ－１转录辅助激活剂，我??们观察到Ｐ３００的蛋白水平在４?ｈ和８?ｈ表达明显升高（图１－４Ｂ）。低氧处理后ＫＭＴ２Ｄ的??蛋白水平随着低氧时间的增加，表达量明显上调（图１－４Ｃ）；其催化的Ｈ３Ｋ４ｍｅｌ的蛋白水??平在低氧１６?ｈ明显增加（图１－４Ｄ）。??Ｈｙｐｏｘｉａ?０?４?８?１６?２４?（ｈ）??——４６０ＫＤ??图１－３?ＫＭＴ２Ｄ抗体特异性检测??Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测ＫＭＴ２Ｄ抗体特异性，整张膜孵ｆｔ抗体，观察足否有丨丨；特性结介。Ｈ??的蛋白分子量约为５９３ＫＤ，大分子量蛋白ｍａｒｋｅｒ（ＬＣ５６９９）最上端条带４６０ＫＤ作为指示标志。??２２??
?第二部分实验结果???录水平。??２．１总ＲＮＡ的完整性鉴定??提取细胞的总ＲＮＡ，对其进行完整性检测，同一批提取的６个样本，通过１．５％琼脂??糖凝胶电泳观察到２８ｓ条带的亮度约为１８ｓ的２倍，５ｓ条带最弱（图２－１?），证明提取的ＲＮＡ??质控合格，可继续下一步实验。??Ｈｙｐｏｘｉａ?０?４?８?１６?２４?２４?（ｈ）??ｋｈ?，／?一、二，??■■■■??＾Ｈ５ｓ??图２－１?ＲＮＡ的完整性检测结果??２．２实时荧光定量ＰＣＲ检测Ｆｅｇｆ和５？／＞３的ｍＲＮＡ表达水平??检测ＨＩＦ－ｌｏｃ下游基因的转录活性，本实验采用ｑＲＴ－ＰＣＲ技术检测ＨＩＦ－ｌａ的下游基因??的ｍＲＮＡ表达水平。因为在低氧应激状态下，机体能调动一系列与血管生成、糖代谢、细??胞凋亡等生理病理过程相关基因表达，本实验对心肌梗死损伤修复过程中，促进血管生成??过程发挥重要作用的血管内皮生长因子ＶＥＧＦ以及细胞凋亡过程中的关键因子ＢＮＩＰ３进??行检测。结果如图２－２所示，低氧处理不同时间后，设＃的ｍＲＮＡ表达水平在低氧４?ｈ后??显著上调且随着低氧时间的延长有逐步上升的趋势（图２－２Ａ）；?的ｍＲＮＡ水平在低??氧处理后有明显升高，且在１６ｈ表达量最高（图２－２Ｂ）。??２４??
【参考文献】：
期刊论文
[1]表观遗传学研究进展[J]. 丁勇,许超,吴季辉,施蕴渝,臧建业,蔡刚. 中国科学:生命科学. 2017(01)
[2]组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1抑制剂的研究进展[J]. 吴丽明,邹芳霞,席佳越,周金培,查晓明. 药学进展. 2016(07)
[3]低氧诱导因子-1与缺血性心肌损伤保护的研究进展[J]. 丁然然,哈艳平,王振良,雷洪,申志华,郭峻莉,揭伟. 中国细胞生物学学报. 2015(10)
[4]表观遗传学及其与疾病相关性[J]. 李文,边育红,褚晓倩. 中国细胞生物学学报. 2013(02)
本文编号：3273186
【文章来源】：南京中医药大学江苏省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１心肌缺血２４?ｈ后，ｍｌｌＷ组和ｍｌｌ４－ｃＫＯ组小鼠心肌组织染色??
?第二部分实验结果???平，并且观察蛋白表达水平与低氧时间点的关系。因这些蛋白都表达在细胞核内，提取核??蛋白，取１０?｜！ｇ进行Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测。ＫＭＴ２Ｄ蛋白分子量较大，经过探索采取浓度??为６％的分离胶进行电泳，ＫＭＴ２Ｄ抗体目前市面上未销售，有戈凯教授实验室赠送。首先??对其抗体特异性进行检测，结果（图１－３）显示，ＫＭＴ２Ｄ抗体可用于后续实验。结果如（图??１－４）所示：组蛋白ＨｉｓｔｏｎｅＨ３作为细胞核内参蛋白，在不同时间点表达量一致；与常氧组??（Ｏｈ）相比，ＨＩＦ－ｌａ在低氧处理后蛋白量积累，低氧４ｈ时蛋白积累量升高，８ｈ后蛋白积??累量达到最多，１６ｈ蛋白水平积累下降（图１－４Ａ）；?Ｐ３００作为ＨＩＦ－１转录辅助激活剂，我??们观察到Ｐ３００的蛋白水平在４?ｈ和８?ｈ表达明显升高（图１－４Ｂ）。低氧处理后ＫＭＴ２Ｄ的??蛋白水平随着低氧时间的增加，表达量明显上调（图１－４Ｃ）；其催化的Ｈ３Ｋ４ｍｅｌ的蛋白水??平在低氧１６?ｈ明显增加（图１－４Ｄ）。??Ｈｙｐｏｘｉａ?０?４?８?１６?２４?（ｈ）??——４６０ＫＤ??图１－３?ＫＭＴ２Ｄ抗体特异性检测??Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测ＫＭＴ２Ｄ抗体特异性，整张膜孵ｆｔ抗体，观察足否有丨丨；特性结介。Ｈ??的蛋白分子量约为５９３ＫＤ，大分子量蛋白ｍａｒｋｅｒ（ＬＣ５６９９）最上端条带４６０ＫＤ作为指示标志。??２２??
?第二部分实验结果???录水平。??２．１总ＲＮＡ的完整性鉴定??提取细胞的总ＲＮＡ，对其进行完整性检测，同一批提取的６个样本，通过１．５％琼脂??糖凝胶电泳观察到２８ｓ条带的亮度约为１８ｓ的２倍，５ｓ条带最弱（图２－１?），证明提取的ＲＮＡ??质控合格，可继续下一步实验。??Ｈｙｐｏｘｉａ?０?４?８?１６?２４?２４?（ｈ）??ｋｈ?，／?一、二，??■■■■??＾Ｈ５ｓ??图２－１?ＲＮＡ的完整性检测结果??２．２实时荧光定量ＰＣＲ检测Ｆｅｇｆ和５？／＞３的ｍＲＮＡ表达水平??检测ＨＩＦ－ｌｏｃ下游基因的转录活性，本实验采用ｑＲＴ－ＰＣＲ技术检测ＨＩＦ－ｌａ的下游基因??的ｍＲＮＡ表达水平。因为在低氧应激状态下，机体能调动一系列与血管生成、糖代谢、细??胞凋亡等生理病理过程相关基因表达，本实验对心肌梗死损伤修复过程中，促进血管生成??过程发挥重要作用的血管内皮生长因子ＶＥＧＦ以及细胞凋亡过程中的关键因子ＢＮＩＰ３进??行检测。结果如图２－２所示，低氧处理不同时间后，设＃的ｍＲＮＡ表达水平在低氧４?ｈ后??显著上调且随着低氧时间的延长有逐步上升的趋势（图２－２Ａ）；?的ｍＲＮＡ水平在低??氧处理后有明显升高，且在１６ｈ表达量最高（图２－２Ｂ）。??２４??
【参考文献】：
期刊论文
[1]表观遗传学研究进展[J]. 丁勇,许超,吴季辉,施蕴渝,臧建业,蔡刚. 中国科学:生命科学. 2017(01)
[2]组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1抑制剂的研究进展[J]. 吴丽明,邹芳霞,席佳越,周金培,查晓明. 药学进展. 2016(07)
[3]低氧诱导因子-1与缺血性心肌损伤保护的研究进展[J]. 丁然然,哈艳平,王振良,雷洪,申志华,郭峻莉,揭伟. 中国细胞生物学学报. 2015(10)
[4]表观遗传学及其与疾病相关性[J]. 李文,边育红,褚晓倩. 中国细胞生物学学报. 2013(02)
本文编号：3273186
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3273186.html
最近更新
教材专著
