烟草单倍体基因编辑系统的建立
发布时间：2021-07-21 19:44
【背景和目的】单倍体材料作为转化受体具有不受同源染色体联会配对影响、转化效率较高、外源基因在后代基因组中稳定性较好、加倍后即可获得纯合转化植株等优点,结合基因编辑CRISPR/Cas9系统,可大大加快烟草品种选育进程。【方法】通过花粉离体培育获得单倍体,利用CRISPR/Cas9系统编辑八氢番茄红素脱氢酶基因位点,产生白化单倍体植株。【结果】（1）经过4℃处理4～6天的实验组,花药愈伤组织形成率最高可达11%;（2）获得转化后单倍体植株120株,其中白化86株（白化率71.67%）,红花大金元51株,其中白化24株（白化率47.06%）。【结论】（1）适当低温处理可提高花药培育单倍体效率;（2）以单倍体为受体的基因编辑效率有所提高。
【文章来源】：中国烟草学报. 2020,26(05)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
PDS基因编辑质粒图谱
取第5片真叶观察下表皮气孔保卫细胞中叶绿体数，叶绿体数分界以15和26为临界指标，叶绿体数少于15的为单倍体，多于15而少于26的为四倍体。碘液染色后鉴别结果如图2 E-F所示，分别为单倍体和四倍体第5片真叶下表皮保卫细胞。单倍体（图2 E）绝大部分气孔保卫细胞中叶绿体数在7～13，四倍体（图2 F）的叶绿体数绝大部分在14～23。并且可以看出，单倍体气孔保卫细胞形状近圆，较四倍体小。2.2 单倍体PDS基因编辑遗传转化结果
图3 单倍体转化植株及分子检测结果在烟草育种工作中，育种目标是获得具有目的性状的纯合体。单倍体的染色体数是正常体细胞染色体数的1/2，理论上在单倍体中基因位点被编辑成功的概率更高，且编辑成功的单倍体加倍后获得的双单倍体即为纯合体，但烟草是异源四倍体，含四套染色体组，单倍体也含两套染色体组，故在T0代中仍会出现杂合情况，需要进一步筛选单倍体T0代中的位点纯合编辑体。本研究利用PDS基因在编辑后产生白化植株作为编辑成功的可视化标志，故在T0代白化植株中随机选择各10株进行编辑靶点分子检测，结果显示10株单倍体白化植株中8株为编辑位点纯合，10株红花大金元（四倍体）白化植株中4株为编辑位点纯合，可见单倍体白化植株中编辑位点纯合的概率较四倍体更高。并且在经过遗传转化和组织培养后，获得的T0代植株中，单倍体出现白化苗的概率（71.67%）也较红花大金元出现白化苗的概率（47.06%）高。作为对照组的红花大金元T0代白化植株中出现嵌合体，而在单倍体实验组中没有出现嵌合体。在T0代白化植株中，位点纯合和杂合编辑体在表型上并无明显差异，还需辅助分子检测等手段筛选纯合编辑植株。在T0代绿色植株中，可能存在编辑但无性状的情况（可能只编辑了一条染色体），需要分子检测或者自交后确认，但本实验旨在T0代即可筛选出编辑成功的位点纯合编辑单倍体，故对该部分实验材料未进行进一步检测。这显示了单倍体作为受体材料的优势，单倍体细胞内基因发生的任何变化都可以通过染色体加倍一次性纯合[27]。传统育种获得纯合稳定品系需要连续7代自交和选择，且无法实现所有性状的绝对纯合，而双单倍体技术只需1～2代即可获得遗传上100%纯合的品系[28]。以单倍体作为基因编辑受体材料，如再利用单倍体加倍技术，可使后代迅速纯合并稳定遗传。
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物单倍体诱导技术发展与创新[J]. 陈海强,刘会云,王轲,张双喜,叶兴国. 遗传. 2020(05)
[2]CRISPR/Cas9介导的植物基因编辑技术研究进展[J]. 时欢,林玉玲,赖钟雄,杜宜殷,黄鹏林. 应用与环境生物学报. 2018(03)
[3]普通烟草八氢番茄红素脱氢酶基因的原核表达及表达谱分析[J]. 钟晓武,付强,邹颉,林世峰,郭玉双,赵杰宏,任学良. 植物遗传资源学报. 2014(04)
[4]基因组编辑技术在植物中的研究进展与应用前景[J]. 谢科,饶力群,李红伟,安学丽,方才臣,万向元. 中国生物工程杂志. 2013(06)
[5]6个烟草杂交组合花药再生苗的培养和DH群体的构建[J]. 陈学军,彭双玉,罗建蓉,杨彦明,肖炳光. 植物资源与环境学报. 2011(01)
[6]草莓八氢番茄红素脱氢酶基因pds的克隆及特征分析[J]. 朱海生,李永平,温庆放,林珲. 园艺学报. 2011(01)
[7]花药离体培养研究进展[J]. 王茂良,冯慧. 北京农学院学报. 2010(03)
[8]低温预处理对烟草花药培养诱导率的影响[J]. 陈春艳,刘仁祥,雷红梅,刘胜传,王颖. 贵州农业科学. 2010(05)
[9]以单倍体材料为转化受体的植物转基因研究进展[J]. 杜志钊,陆瑞菊,黄剑华. 核农学报. 2010(02)
[10]八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因分子进化特征[J]. 梁成伟,程江峰,苏忠亮,梁琰,王帅. 青岛科技大学学报(自然科学版). 2009(05)
本文编号：3295652
【文章来源】：中国烟草学报. 2020,26(05)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
PDS基因编辑质粒图谱
取第5片真叶观察下表皮气孔保卫细胞中叶绿体数，叶绿体数分界以15和26为临界指标，叶绿体数少于15的为单倍体，多于15而少于26的为四倍体。碘液染色后鉴别结果如图2 E-F所示，分别为单倍体和四倍体第5片真叶下表皮保卫细胞。单倍体（图2 E）绝大部分气孔保卫细胞中叶绿体数在7～13，四倍体（图2 F）的叶绿体数绝大部分在14～23。并且可以看出，单倍体气孔保卫细胞形状近圆，较四倍体小。2.2 单倍体PDS基因编辑遗传转化结果
图3 单倍体转化植株及分子检测结果在烟草育种工作中，育种目标是获得具有目的性状的纯合体。单倍体的染色体数是正常体细胞染色体数的1/2，理论上在单倍体中基因位点被编辑成功的概率更高，且编辑成功的单倍体加倍后获得的双单倍体即为纯合体，但烟草是异源四倍体，含四套染色体组，单倍体也含两套染色体组，故在T0代中仍会出现杂合情况，需要进一步筛选单倍体T0代中的位点纯合编辑体。本研究利用PDS基因在编辑后产生白化植株作为编辑成功的可视化标志，故在T0代白化植株中随机选择各10株进行编辑靶点分子检测，结果显示10株单倍体白化植株中8株为编辑位点纯合，10株红花大金元（四倍体）白化植株中4株为编辑位点纯合，可见单倍体白化植株中编辑位点纯合的概率较四倍体更高。并且在经过遗传转化和组织培养后，获得的T0代植株中，单倍体出现白化苗的概率（71.67%）也较红花大金元出现白化苗的概率（47.06%）高。作为对照组的红花大金元T0代白化植株中出现嵌合体，而在单倍体实验组中没有出现嵌合体。在T0代白化植株中，位点纯合和杂合编辑体在表型上并无明显差异，还需辅助分子检测等手段筛选纯合编辑植株。在T0代绿色植株中，可能存在编辑但无性状的情况（可能只编辑了一条染色体），需要分子检测或者自交后确认，但本实验旨在T0代即可筛选出编辑成功的位点纯合编辑单倍体，故对该部分实验材料未进行进一步检测。这显示了单倍体作为受体材料的优势，单倍体细胞内基因发生的任何变化都可以通过染色体加倍一次性纯合[27]。传统育种获得纯合稳定品系需要连续7代自交和选择，且无法实现所有性状的绝对纯合，而双单倍体技术只需1～2代即可获得遗传上100%纯合的品系[28]。以单倍体作为基因编辑受体材料，如再利用单倍体加倍技术，可使后代迅速纯合并稳定遗传。
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物单倍体诱导技术发展与创新[J]. 陈海强,刘会云,王轲,张双喜,叶兴国. 遗传. 2020(05)
[2]CRISPR/Cas9介导的植物基因编辑技术研究进展[J]. 时欢,林玉玲,赖钟雄,杜宜殷,黄鹏林. 应用与环境生物学报. 2018(03)
[3]普通烟草八氢番茄红素脱氢酶基因的原核表达及表达谱分析[J]. 钟晓武,付强,邹颉,林世峰,郭玉双,赵杰宏,任学良. 植物遗传资源学报. 2014(04)
[4]基因组编辑技术在植物中的研究进展与应用前景[J]. 谢科,饶力群,李红伟,安学丽,方才臣,万向元. 中国生物工程杂志. 2013(06)
[5]6个烟草杂交组合花药再生苗的培养和DH群体的构建[J]. 陈学军,彭双玉,罗建蓉,杨彦明,肖炳光. 植物资源与环境学报. 2011(01)
[6]草莓八氢番茄红素脱氢酶基因pds的克隆及特征分析[J]. 朱海生,李永平,温庆放,林珲. 园艺学报. 2011(01)
[7]花药离体培养研究进展[J]. 王茂良,冯慧. 北京农学院学报. 2010(03)
[8]低温预处理对烟草花药培养诱导率的影响[J]. 陈春艳,刘仁祥,雷红梅,刘胜传,王颖. 贵州农业科学. 2010(05)
[9]以单倍体材料为转化受体的植物转基因研究进展[J]. 杜志钊,陆瑞菊,黄剑华. 核农学报. 2010(02)
[10]八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因分子进化特征[J]. 梁成伟,程江峰,苏忠亮,梁琰,王帅. 青岛科技大学学报(自然科学版). 2009(05)
本文编号：3295652
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