石榴PgKO和PgGA20ox基因的克隆及功能分析
发布时间：2021-07-31 23:16
石榴（Punica granatum L.）为石榴科石榴属的多年生落叶乔木或灌木,是一种既有营养价值又有观赏价值的特色果树。石榴花为两性花,根据雌蕊发育程度的不同分为完全花和不完全花。完全花即筒状花,发育良好坐果率高;不完全花即钟状花发育不正常、易脱落,直接影响了石榴筒状花与钟状花的比例以及石榴的产量。有关研究表明赤霉素是石榴筒状花和钟状花形成的重要影响因素,因此本试验以‘红玉石籽’石榴为试验材料,测定石榴筒状花和钟状花的外形指标与赤霉素含量;克隆石榴赤霉素生物合成途径关键基因（PgKO、PgGA20ox）并分析它们在筒状花和钟状花中的表达特性;同时构建PgKO过表达载体,通过花序浸染法获得转PgKO基因拟南芥株系,对T3代转基因拟南芥进行荧光定量试验。试验所得结果如下:1、克隆得到赤霉素生物合成关键基因PgKO和PgGA2ox的cDNA全长序列。PgKO（登录号:MG208017）全长序列为1729bp,开放阅读框有1542个碱基,非编码区有186个碱基,编码513个氨基酸。GA20ox（登录号:MH104888）全长序列为1676 bp,开放阅读框有993个碱基,非编码区有683个...
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图４－１石榴钟状花和筒状花的外形对比图??
４．２赤霉素在石榴不同花型中的含置分析??测得石榴筒状花和钟状花中的赤霉素含量如（图４－３）所示，筒状花中花柱??的赤霉毒含量最高为５．８３?ｐｇ／ｇ，其次是子房、萼筒、花萼、花瓣，花药的赤霉素??含量最低为２．８９?ｆｉｇ／ｇ，钟状花中子房的赤霉毒含量最高为４．３２?吨／ｇ，其次是花??柱、萼筒、花萼、花瓣，花药的赤霉素含量最低为２．４５?ｐｇ／ｇ，筒状花不同器官部??位的赤霉素含量都高于钟状花，其中子房、花瓣、萼筒、花柱之间的赤霉素含量??呈现出显著性差异，花萼与花药之间的含量呈现出不显著性差异。??＂Ｉ?？莳状花?口钟状花??ｗ?ｃｙｌｉｎｄｒｉｃ－ｓｈａｐｅｄ?ｆｌｏｗｅｒｓ?ｔｒｕｍｐｅｔ－ｓｈａｐｅｄ?ｆｌｏｗｅｒｓ??ｌｌｌｌ?ｌｉ?ｌｌ?１１?ｉｉ?ｌｌ??３?Ｏ????１???１?■■??１?ＩＨ??１???１?■■??１??子房?花瓣?花萼?萼简?花药?花柱??ｏｖａｒｙ?ｐｅｔａｌ?ｃａｌｙｘ?ｃａｌｙｘ?ｔｕｂｅ?ａｎｔｈｅｒ?ｓｔｙｌｅ??图４－３石榴钟状花和筒状花赤霉素含量??Ｆｉｇ．４－３?Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ?ｃｏｎｔｅｎｔ?ｉｎ?ｃｙｌｉｎｄｒｉｃ－ｓｈａｐｅｄ?ｆｌｏｗｅｒｓ?ａｎｄ?ｔｒｕｍｐｅｔ－ｓｈａｐｅｄ?Ｈｏｗｅｒｓ?ｏｆ?ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ??４．?３石榴花中总ＲＮＡ的提取及检测??参照ＲＮＡ提取试剂盒的操作流程，提取石榴花中的总ＲＮＡ，并将产物进行??电泳检测，结果如图４－４所示，提取的总ＲＮＡ条带完整，无拖带，均不含蛋白、??ＤＮＡ和酚类等杂质物，条带清晰明亮，通过核酸测定仪测定０Ｄ值为１．９２，表??明所提ＲＮＡ纯度高，可用于后续实验。??
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【参考文献】：
期刊论文
[1]石榴赤霉素合成相关基因PgKO的克隆及表达分析[J]. 黄蓉,刘娜,王琦,熊枫,张水明. 西北植物学报. 2018(04)
[2]石榴完全花与不完全花的内源激素变化研究[J]. 李进,杨荣萍,洪明伟,吴兴恩,王艳,李松开,李文祥. 云南农业大学学报(自然科学). 2015(06)
[3]赤霉素的生物合成和信号转导研究进展[J]. 熊书. 教育教学论坛. 2015(16)
[4]石榴花果管理技术[J]. 郭晓成,王景波,杨莉. 西北园艺(果树). 2015(02)
[5]异源表达拟南芥赤霉素2–氧化酶基因对矮牵牛形态发育的影响[J]. 余勇,葛文东,邹世慧,杨子,韩垚,秦小婷,杨霞,郭余龙,李名扬. 园艺学报. 2014(10)
[6]内源激素含量变化与板栗花芽分化关系研究[J]. 程华,李琳玲,袁红慧,徐向阳,王燕,程水源. 北方园艺. 2013(22)
[7]影响苹果赤霉素合成的关键酶基因在新梢和幼嫩种子上的表达分析[J]. 刘云龙,王彩虹,白牡丹,田义轲,陈宝印,张伟,李炜. 果树学报. 2013(05)
[8]3个葡萄品种花芽分化过程中内源激素含量变化初报[J]. 林玲,黄羽,谢太理,张瑛,周咏梅,文仁德. 南方农业学报. 2012(06)
[9]板栗野生和芽变雄花序赤霉素合成关键酶基因比较分析[J]. 郭献平,李兴亮,段续伟,邓舒,曹庆芹,秦岭. 中国农业大学学报. 2012(04)
[10]外源激素对蓖麻营养生长及花芽分化的影响[J]. 陈梅,李培旺,蒋丽娟. 中南林业科技大学学报. 2011(07)
博士论文
[1]丹参赤霉素合成与代谢相关基因家族的鉴定、分子克隆及表达分析[D]. 杜清.北京协和医学院 2015
[2]果树GA生物合成基因——贝壳杉烯氧化酶和20-氧化酶的克隆及表达模式的初步研究[D]. 石琰景.山东农业大学 2002
本文编号：3314364
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图４－１石榴钟状花和筒状花的外形对比图??
４．２赤霉素在石榴不同花型中的含置分析??测得石榴筒状花和钟状花中的赤霉素含量如（图４－３）所示，筒状花中花柱??的赤霉毒含量最高为５．８３?ｐｇ／ｇ，其次是子房、萼筒、花萼、花瓣，花药的赤霉素??含量最低为２．８９?ｆｉｇ／ｇ，钟状花中子房的赤霉毒含量最高为４．３２?吨／ｇ，其次是花??柱、萼筒、花萼、花瓣，花药的赤霉素含量最低为２．４５?ｐｇ／ｇ，筒状花不同器官部??位的赤霉素含量都高于钟状花，其中子房、花瓣、萼筒、花柱之间的赤霉素含量??呈现出显著性差异，花萼与花药之间的含量呈现出不显著性差异。??＂Ｉ?？莳状花?口钟状花??ｗ?ｃｙｌｉｎｄｒｉｃ－ｓｈａｐｅｄ?ｆｌｏｗｅｒｓ?ｔｒｕｍｐｅｔ－ｓｈａｐｅｄ?ｆｌｏｗｅｒｓ??ｌｌｌｌ?ｌｉ?ｌｌ?１１?ｉｉ?ｌｌ??３?Ｏ????１???１?■■??１?ＩＨ??１???１?■■??１??子房?花瓣?花萼?萼简?花药?花柱??ｏｖａｒｙ?ｐｅｔａｌ?ｃａｌｙｘ?ｃａｌｙｘ?ｔｕｂｅ?ａｎｔｈｅｒ?ｓｔｙｌｅ??图４－３石榴钟状花和筒状花赤霉素含量??Ｆｉｇ．４－３?Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ?ｃｏｎｔｅｎｔ?ｉｎ?ｃｙｌｉｎｄｒｉｃ－ｓｈａｐｅｄ?ｆｌｏｗｅｒｓ?ａｎｄ?ｔｒｕｍｐｅｔ－ｓｈａｐｅｄ?Ｈｏｗｅｒｓ?ｏｆ?ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ??４．?３石榴花中总ＲＮＡ的提取及检测??参照ＲＮＡ提取试剂盒的操作流程，提取石榴花中的总ＲＮＡ，并将产物进行??电泳检测，结果如图４－４所示，提取的总ＲＮＡ条带完整，无拖带，均不含蛋白、??ＤＮＡ和酚类等杂质物，条带清晰明亮，通过核酸测定仪测定０Ｄ值为１．９２，表??明所提ＲＮＡ纯度高，可用于后续实验。??
１?Ｍ?２??２００Ｄｂｐ??ｌｏｏｏｂｐ??７５０ｂｐ??５００ｂｐ??２５０ｂｐ??ｌＯＤｂｐ??图４－４石榴花中总ＲＮＡ的提取??Ｆｉｇ．４－４?Ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｏｆ?ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ?ｆｌｏｗｅｒｓ??４．?４石榴赤霉素生物合成途径中关键基因的克隆??４．４．１?基因的克隆及生物信息学分析??４．４．１．１作奶基因的克隆??根据ＮＣＢ丨中己登入的其他物种幻９基因的保守序列，设计内围兼并引物??尺０－Ｆ２／尤Ｏ－Ｒｌ进行第一轮ＰＣＲ，之后以此产物为模板用外围兼并引物??人Ｙ）－Ｆｌ／ＫＯ－Ｒ２进行第二轮ＰＣＲ，扩增得到长度为２６８?ｂｐ核酸片段（图４－５，?Ａ），??用胶回收试剂盒对条带进行胶回收，连接载体转大肠杆菌，将培养菌液送至生物??公司进行测序。序列比对后，确定该扩增得到的是ＰｇＡ：０基因序列。在获取的中??间片断基础上，继续设计引物火０－５’０５？丨／１０）－５＇０５？２，按照５＼＾１＾＾？１＾八０￡??ｃＤＮＡ?Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?Ｋｉｔ?（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）操作步骤，采用巢式ＰＣＲ法，以内围引物和??ＵＰＭ?Ｌｏｎｇ引物进行第一轮ＰＣＲ扩增，再以产物为模板，使用外围引物和ＮＵＰ??引物进行第二轮ＰＣＲ扩增。用胶回收试剂盒对长度正确的条带进行胶回收，并??连接转化，挑取ＰＣＲ检测有条带的阳性菌液送至生物公司测序，最后得到长度??为７９２?ｂｐ的目的片段（图４－５，Ｂ），在ＮＣＢＩ中进行ＢＬＡＳＴ，确定该扩增得到的??是尸＃０的５＇端序列。??根据克隆得到的的中间片断，使用Ｐｒｉｍｅｒ?５．０软件设计引物??Ａ：０－３＇ＧＳＰｌ／／：ａ３＇ＧＳＰ２，同样采用巢式ＰＣＲ法，
【参考文献】：
期刊论文
[1]石榴赤霉素合成相关基因PgKO的克隆及表达分析[J]. 黄蓉,刘娜,王琦,熊枫,张水明. 西北植物学报. 2018(04)
[2]石榴完全花与不完全花的内源激素变化研究[J]. 李进,杨荣萍,洪明伟,吴兴恩,王艳,李松开,李文祥. 云南农业大学学报(自然科学). 2015(06)
[3]赤霉素的生物合成和信号转导研究进展[J]. 熊书. 教育教学论坛. 2015(16)
[4]石榴花果管理技术[J]. 郭晓成,王景波,杨莉. 西北园艺(果树). 2015(02)
[5]异源表达拟南芥赤霉素2–氧化酶基因对矮牵牛形态发育的影响[J]. 余勇,葛文东,邹世慧,杨子,韩垚,秦小婷,杨霞,郭余龙,李名扬. 园艺学报. 2014(10)
[6]内源激素含量变化与板栗花芽分化关系研究[J]. 程华,李琳玲,袁红慧,徐向阳,王燕,程水源. 北方园艺. 2013(22)
[7]影响苹果赤霉素合成的关键酶基因在新梢和幼嫩种子上的表达分析[J]. 刘云龙,王彩虹,白牡丹,田义轲,陈宝印,张伟,李炜. 果树学报. 2013(05)
[8]3个葡萄品种花芽分化过程中内源激素含量变化初报[J]. 林玲,黄羽,谢太理,张瑛,周咏梅,文仁德. 南方农业学报. 2012(06)
[9]板栗野生和芽变雄花序赤霉素合成关键酶基因比较分析[J]. 郭献平,李兴亮,段续伟,邓舒,曹庆芹,秦岭. 中国农业大学学报. 2012(04)
[10]外源激素对蓖麻营养生长及花芽分化的影响[J]. 陈梅,李培旺,蒋丽娟. 中南林业科技大学学报. 2011(07)
博士论文
[1]丹参赤霉素合成与代谢相关基因家族的鉴定、分子克隆及表达分析[D]. 杜清.北京协和医学院 2015
[2]果树GA生物合成基因——贝壳杉烯氧化酶和20-氧化酶的克隆及表达模式的初步研究[D]. 石琰景.山东农业大学 2002
本文编号：3314364
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