柞蚕表皮构建相关CP12、CP23及BLOS2基因的表达特征及功能研究
发布时间：2021-08-17 11:50
昆虫表皮是昆虫体壁皮细胞分泌物形成的一种高度有序的层状结构,主要由表皮蛋白（Cuticular Proteins,CP）和几丁质构成。表皮蛋白基因的种类和数量变化是影响表皮结构及其机械性能的主要因素,其中CP中的一类CPR家族在昆虫中含量最多,具有与几丁质结合能力的R&R保守序列,分为3个亚族RR-1、RR-2和RR-3,都与昆虫表皮形成有关。另一方面,昆虫表皮的不透明与尿酸盐颗粒在皮细胞中积累有关,能减少光氧化对昆虫的刺激。尿酸盐颗粒转运相关的BLOS2基因在此过程中起着十分重要的作用。研究发现BLOS2突变会使昆虫表皮呈半透明状,而柞蚕中暂未发现半透明突变体。为了探究CP和BLOS2基因的表达模式及其在柞蚕（Antheraea pernyi）表皮构建中的作用,采用分子生物学技术研究了3个基因特征和表达模式,并通过RNAi技术探究基因功能,为解析柞蚕体壁的构建奠定基础,实验结果如下。1.克隆得到了柞蚕RR-1亚族的2种表皮蛋白（cuticular proteins,CPs）基因,分别命名为ApCP12、ApCP23（GenBank登录号:MF318874、MF318875）。...
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
昆虫体内尿酸合成及转运途径Fig.1-1Uricacidsynthesisandtransportpathwaysininsects
沈阳农业大学硕士学位论文192.2结果与分析2.2.1柞蚕CP12和CP23基因的克隆及序列分析参照表2-2中表皮蛋白基因序列扩增引物，分别经PCR扩增及3RACE扩增后得到CP12基因长度为690bp，ORF长度为336bp，编码111个氨基酸，相对分子质量为12kD，等电点为4.80。BLASTp分析表明，该基因与天蚕Antheraeayamamai的cuticularprotein1（登录号:AER27813.1）相似度为92%。根据预测的分子量大小将其命名为ApCP12（GenBank登录号：MF318874）。ApCP12预测有一个信号肽（位于1-17位编码氨基酸，浅灰色部分），具有一个几丁质结合结构域Chitin_bind_4（位于38-97位氨基酸之间，深灰色部分）（图2-1：A）。柞蚕CP23测序结果拼接后长度为1243bp，ORF长度为594bp，编码197个氨基酸，相对分子质量为23kD，等电点为5.57。BLASTp分析表明，与家蚕cuticularproteinmotif1（登录号：NP_001040112.1）的相似度为89%，根据分子量大小将其命名为ApCP23（GenBank登录号：MF318875）。ApCP23预测信号肽序列位于1-19个编码氨基酸（浅灰色部分），几丁质结合结构域Chitin_bind_4位于121-176位氨基酸之间（深灰色部分）（图2-1：B）。起始密码子ATG用粗体标注，终止密码子TAA用粗体和星号标注，浅灰色阴影表示信号肽序列，深灰色阴影表示几丁质结合结构域。TheinitiationcodonATGisbold,andtheterminationcodonTAAisboldandmarkedwithanasterisk.Thesignalpeptidesareshadedinlightgrey,andtheconserveddomainsofchitinbindareshadedindarkgrey.图2-1柞蚕ApCP12(A)和ApCP23(B)的cDNA核酸序列及推导的氨基酸序列Fig.2-1NucleotideanddeducedaminoacidsequencesofApCP12(A)andApCP23(B)ofA.pernyi
CPRR-122（登录号：NP_001166266.1）；家蚕：CPRR-1motif1（登录号：NP_001040112.1）；日本天蚕：CPRR-1motif8（登录号：AER27816.1）；冬尺蠖O.brumata：CPRR-1motif15（登录号：KOB72386.1）；黑脉金斑蝶D.plexippus：CPRR-1motif17（登录号：OWR54751.1）；家蚕：CPRR-1motif45（登录号：NP_001036869.1）等，柞蚕CP12、CP23与以上昆虫表皮蛋白具有CPR家族RR-1亚族共同的保守基序（GxFxYxxPDGxxxxVxYxADENGYQPxGAHLP），保守序列通过WebLogo分析后生成的序列logo见图2-4（图中字母为氨基酸缩写，其高低代表保守性）。图2-49种昆虫RR-1亚族表皮蛋白的氨基酸序列的WebLogo保守域预测Fig.2-4PredictedWebLogoconservativedomainsofcuticularproteins(CPs)ofsubtribeRR-1innineinsectspecies2.2.3ApCP12和ApCP23基因组织及胚胎发育期的半定量分析采用半定量RT-PCR检测柞蚕5龄幼虫各组织中2种表皮蛋白基因的表达量变化，ApCP12在柞蚕5龄幼虫的中肠、马氏管及血淋巴中未检测到基因表达，而表皮、肌肉、脂肪体、丝腺、脑、精/卵巢中均有表达，ApCP23基因除在柞蚕的表皮、肌肉中表达量较高外，在脂肪体、丝腺、血淋巴、脑、精/卵巢中也有少量表达（图2-5）。1:表皮Cuticle;2：肌肉Muscles；3:脂肪体Fatbody;4:中肠Midgut;5:丝腺Silkgland;6:马氏管Malpighiantubes;7:血淋巴Haemolymph;8:脑Brain;9:精/卵巢Spermaries/Ovaries图2-5柞蚕5龄幼虫各组织中ApCP12和ApCP23的半定量RT-PCR检测Fig.2-5Semi-quantitativeRT-PCRdetectApCP12andApCP23expressionindifferenttissuesof5thinstarlarvaeofA.pernyi123456789-actinApCP12ApCP23
【参考文献】：
期刊论文
[1]柞蚕胆绿素还原酶基因ApBVRB的克隆及表达分析[J]. 苗隆,谢璐,李群,刘彦群. 蚕业科学. 2019(02)
[2]柞蚕RR-1亚族表皮蛋白基因ApCP12与ApCP23的表达特征与功能分析[J]. 马月月,刘微,王勇,王德意,雷飘,汝玉涛,姜义仁,杨瑞生,秦利. 昆虫学报. 2018(02)
[3]蜕皮激素受体和超气门蛋白基因在柞蚕发育过程及激素诱导后的表达模式[J]. 汝玉涛,王勇,周敬林,王德意,马月月,姜义仁,高清,秦利. 蚕业科学. 2017(04)
[4]飞蝗内表皮蛋白基因LmAbd-5的表达与功能分析[J]. 赵小明,贾盼,勾昕,刘卫敏,马恩波,张建珍. 中国农业科学. 2017(10)
[5]家蚕吡哆醛激酶基因干扰降低转氨酶基因的转录表达[J]. 姚丽丽,杨欢欢,张剑韵,黄龙全. 昆虫学报. 2015 (12)
[6]飞蝗表皮蛋白Obstructor家族基因的分子特性及基于RNAi的功能分析[J]. 王燕,李大琪,刘晓健,李涛,马恩波,范仁俊,张建珍. 中国农业科学. 2015(01)
[7]昆虫表皮蛋白基因研究进展[J]. 梁欣,陈斌,乔梁. 昆虫学报. 2014(09)
[8]褐飞虱表皮蛋白基因NlICP的克隆及功能研究[J]. 马艳,郝培应,陆潮峰,俞晓平. 昆虫学报. 2013(11)
[9]内体—溶酶体运输及其细胞功能[J]. 郝振华,李巍. 生命科学. 2010(11)
[10]昆虫表皮蛋白及其基因表达调控机理的研究进展[J]. 刘清明,苑园园,林健荣,钟杨生. 昆虫知识. 2010(02)
本文编号：3347710
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
昆虫体内尿酸合成及转运途径Fig.1-1Uricacidsynthesisandtransportpathwaysininsects
沈阳农业大学硕士学位论文192.2结果与分析2.2.1柞蚕CP12和CP23基因的克隆及序列分析参照表2-2中表皮蛋白基因序列扩增引物，分别经PCR扩增及3RACE扩增后得到CP12基因长度为690bp，ORF长度为336bp，编码111个氨基酸，相对分子质量为12kD，等电点为4.80。BLASTp分析表明，该基因与天蚕Antheraeayamamai的cuticularprotein1（登录号:AER27813.1）相似度为92%。根据预测的分子量大小将其命名为ApCP12（GenBank登录号：MF318874）。ApCP12预测有一个信号肽（位于1-17位编码氨基酸，浅灰色部分），具有一个几丁质结合结构域Chitin_bind_4（位于38-97位氨基酸之间，深灰色部分）（图2-1：A）。柞蚕CP23测序结果拼接后长度为1243bp，ORF长度为594bp，编码197个氨基酸，相对分子质量为23kD，等电点为5.57。BLASTp分析表明，与家蚕cuticularproteinmotif1（登录号：NP_001040112.1）的相似度为89%，根据分子量大小将其命名为ApCP23（GenBank登录号：MF318875）。ApCP23预测信号肽序列位于1-19个编码氨基酸（浅灰色部分），几丁质结合结构域Chitin_bind_4位于121-176位氨基酸之间（深灰色部分）（图2-1：B）。起始密码子ATG用粗体标注，终止密码子TAA用粗体和星号标注，浅灰色阴影表示信号肽序列，深灰色阴影表示几丁质结合结构域。TheinitiationcodonATGisbold,andtheterminationcodonTAAisboldandmarkedwithanasterisk.Thesignalpeptidesareshadedinlightgrey,andtheconserveddomainsofchitinbindareshadedindarkgrey.图2-1柞蚕ApCP12(A)和ApCP23(B)的cDNA核酸序列及推导的氨基酸序列Fig.2-1NucleotideanddeducedaminoacidsequencesofApCP12(A)andApCP23(B)ofA.pernyi
CPRR-122（登录号：NP_001166266.1）；家蚕：CPRR-1motif1（登录号：NP_001040112.1）；日本天蚕：CPRR-1motif8（登录号：AER27816.1）；冬尺蠖O.brumata：CPRR-1motif15（登录号：KOB72386.1）；黑脉金斑蝶D.plexippus：CPRR-1motif17（登录号：OWR54751.1）；家蚕：CPRR-1motif45（登录号：NP_001036869.1）等，柞蚕CP12、CP23与以上昆虫表皮蛋白具有CPR家族RR-1亚族共同的保守基序（GxFxYxxPDGxxxxVxYxADENGYQPxGAHLP），保守序列通过WebLogo分析后生成的序列logo见图2-4（图中字母为氨基酸缩写，其高低代表保守性）。图2-49种昆虫RR-1亚族表皮蛋白的氨基酸序列的WebLogo保守域预测Fig.2-4PredictedWebLogoconservativedomainsofcuticularproteins(CPs)ofsubtribeRR-1innineinsectspecies2.2.3ApCP12和ApCP23基因组织及胚胎发育期的半定量分析采用半定量RT-PCR检测柞蚕5龄幼虫各组织中2种表皮蛋白基因的表达量变化，ApCP12在柞蚕5龄幼虫的中肠、马氏管及血淋巴中未检测到基因表达，而表皮、肌肉、脂肪体、丝腺、脑、精/卵巢中均有表达，ApCP23基因除在柞蚕的表皮、肌肉中表达量较高外，在脂肪体、丝腺、血淋巴、脑、精/卵巢中也有少量表达（图2-5）。1:表皮Cuticle;2：肌肉Muscles；3:脂肪体Fatbody;4:中肠Midgut;5:丝腺Silkgland;6:马氏管Malpighiantubes;7:血淋巴Haemolymph;8:脑Brain;9:精/卵巢Spermaries/Ovaries图2-5柞蚕5龄幼虫各组织中ApCP12和ApCP23的半定量RT-PCR检测Fig.2-5Semi-quantitativeRT-PCRdetectApCP12andApCP23expressionindifferenttissuesof5thinstarlarvaeofA.pernyi123456789-actinApCP12ApCP23
【参考文献】：
期刊论文
[1]柞蚕胆绿素还原酶基因ApBVRB的克隆及表达分析[J]. 苗隆,谢璐,李群,刘彦群. 蚕业科学. 2019(02)
[2]柞蚕RR-1亚族表皮蛋白基因ApCP12与ApCP23的表达特征与功能分析[J]. 马月月,刘微,王勇,王德意,雷飘,汝玉涛,姜义仁,杨瑞生,秦利. 昆虫学报. 2018(02)
[3]蜕皮激素受体和超气门蛋白基因在柞蚕发育过程及激素诱导后的表达模式[J]. 汝玉涛,王勇,周敬林,王德意,马月月,姜义仁,高清,秦利. 蚕业科学. 2017(04)
[4]飞蝗内表皮蛋白基因LmAbd-5的表达与功能分析[J]. 赵小明,贾盼,勾昕,刘卫敏,马恩波,张建珍. 中国农业科学. 2017(10)
[5]家蚕吡哆醛激酶基因干扰降低转氨酶基因的转录表达[J]. 姚丽丽,杨欢欢,张剑韵,黄龙全. 昆虫学报. 2015 (12)
[6]飞蝗表皮蛋白Obstructor家族基因的分子特性及基于RNAi的功能分析[J]. 王燕,李大琪,刘晓健,李涛,马恩波,范仁俊,张建珍. 中国农业科学. 2015(01)
[7]昆虫表皮蛋白基因研究进展[J]. 梁欣,陈斌,乔梁. 昆虫学报. 2014(09)
[8]褐飞虱表皮蛋白基因NlICP的克隆及功能研究[J]. 马艳,郝培应,陆潮峰,俞晓平. 昆虫学报. 2013(11)
[9]内体—溶酶体运输及其细胞功能[J]. 郝振华,李巍. 生命科学. 2010(11)
[10]昆虫表皮蛋白及其基因表达调控机理的研究进展[J]. 刘清明,苑园园,林健荣,钟杨生. 昆虫知识. 2010(02)
本文编号：3347710
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