柞蚕凝集素基因ApCTL的克隆及表达分析

发布时间：2021-09-01 00:54

　　柞蚕作为无脊椎动物,不具备获得性免疫,主要依赖发达的天然免疫系统抵御病原微生物的入侵。昆虫的天然免疫系统主要包括物理防御、体液免疫和细胞免疫三个部分。天然免疫始于对病原微生物的识别,这一过程是通过昆虫体内的模式识别受体识别并结合病原微生物表面特有的模式分子实现的。模式识别受体与病原体相关性分子模式的相互作用会诱导一系列免疫应答反应,包括吞噬作用、黑化作用及产生抗菌肽、抗病毒因子等,从而激活宿主的防御系统。由于其结合碳水化合物的能力,凝集素在许多生物过程中都起着重要作用,包括蛋白质合成和运输,细胞信号传导,病原微生物识别等。凝集素作为一种模式识别受体,序列中含有特异性碳水化合物识别结构域CRD,不同的CRD具有特有的结构并能够识别病原微生物表面特定的模式分子,从而激活昆虫免疫防御系统。其中C型凝集素是天然免疫模式识别受体的一个主要家族,也是最大的动物凝集素家族之一,其对病原体表面上的糖蛋白和糖脂都有很好的结合能力。本研究以5种微生物对柞蚕蛹进行诱导处理,检测了柞蚕凝集素基因的诱导表达情况,探索凝集素基因在不同诱导条件下在不同组织中的表达差异,为深入研究凝集素在柞蚕免疫系统中的作用机制及激... 

【文章来源】：大连理工大学辽宁省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 文献综述
    1.1 昆虫免疫
    1.2 模式识别受体
    1.3 天然免疫对感染的应答
    1.4 柞蚕病毒简介
    1.5 研究技术路线
    1.6 研究目的及意义
2 柞蚕凝集素基因的表达谱分析
    2.1 引言
    2.2 实验材料和试剂
        2.2.1 实验材料
        2.2.2 主要生化试剂
        2.2.3 主要溶液配制
    2.3 实验方法
        2.3.1 实时定量PCR引物的设计
        2.3.2 柞蚕蛹的诱导
        2.3.3 柞蚕蛹组织RNA的提取和cDNA的合成
        2.3.4 柞蚕凝集素基因诱导表达的实时定量PCR检测
    2.4 结果与分析
        2.4.1 RNA的纯度检测
        2.4.2 柞蚕凝集因素基因在不同病原微生物处理下的表达谱分析
    2.5 讨论
    2.6 小结
3 柞蚕ApCTL基因的克隆及生物信息学分析
    3.1 引言
    3.2 实验材料与试剂
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 主要生化试剂
        3.2.3 常用溶液配制
    3.3 实验方法
        3.3.1 柞蚕蛹诱导、RNA的提取及cDNA的合成
        3.3.2 柞蚕ApCTL基因的克隆
        3.3.3 柞蚕ApCTL基因生物信息学分析
        3.3.4 基于同源建模的柞蚕ApCTL基因功能分析
    3.4 结果与分析
        3.4.1 柞蚕ApCTL基因的克隆
        3.4.2 酶切鉴定
        3.4.3 柞蚕ApCTL基因的序列分析
        3.4.4 蛋白质性质分析
        3.4.5 柞蚕ApCTL基因同源性分析
        3.4.6 同源建模功能分析
    3.5 讨论
    3.6 小结
4 柞蚕ApCTL基因表达载体的构建及重组病毒的筛选
    4.1 引言
    4.2 实验材料与试剂
        4.2.1 实验材料
        4.2.2 工具酶与试剂
        4.2.3 主要试剂配制
    4.3 实验方法
        4.3.1 转移表达载体pApM748BE-CTL的构建
        4.3.2 昆虫Tn-Hi5细胞的复苏与培养
        4.3.3 转移表达载体质粒pApM748BE-CTL与重组病毒ApNPV-Δph/egfp~+基因组DNA共转染
        4.3.4 重组病毒ApNPV-CTL的筛选与PCR鉴定
    4.4 结果与分析
        4.4.1 ApNPV转移表达载体pApM748BE-CTL的构建与鉴定
        4.4.2 共转染与重组病毒的筛选结果
        4.4.3 重组病毒ApNPV-Δph/Δegfp/CTL的鉴定
    4.5 讨论
    4.6 小结
5 柞蚕重组ApCTL凝集素蛋白表达纯化与活性检测
    5.1 引言
    5.2 实验材料与试剂
        5.2.1 实验材料
        5.2.2 主要溶液配制
    5.3 实验方法
        5.3.1 重组凝集素蛋白ApCTL在柞蚕体内的表达
        5.3.2 发病柞蚕蛹预处理
        5.3.3 重组凝集素ApCTL纯化方法的初步建立
        5.3.4 重组凝集素ApCTL的鉴定
        5.3.5 重组凝集素ApCTL凝集活性检测
    5.4 结果与分析
        5.4.1 重组凝集素ApCTL的硫酸铵沉淀
        5.4.2 重组凝集素ApCTL镍柱亲和层析
        5.4.3 重组凝集素ApCTL凝胶过滤层析
        5.4.4 重组凝集素ApCTL凝菌活性检测
        5.4.5 重组凝集素ApCTL凝血活性检测
    5.5 讨论
    5.6 小结
结论
参考文献
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢



本文编号：3375953