玉米ZmCYP72A5基因的功能研究
发布时间：2021-09-04 14:35
细胞色素P450（cytochrome P450,CYP450）是一类古老的血红素硫蛋白的超家族基因,广泛存在于动植物、细菌、真菌等物种的细胞内,参与了生物生长发育过程中多种物质的合成与代谢。研究表明CYP450氧化酶家族基因在植物的抗虫、抗除草剂等抗性方面具有重要的调控作用,但在玉米（Zea mays L.）发育调控中的作用并不清楚。本研究通过基因编辑技术造成玉米ZmCYP72A5基因的缺失进而研究其在玉米生长发育中的功能。主要结果如下:玉米ZmCYP72A5基因位于3号染色体上,基因全长1853 bp,其中编码区1581 bp,共编码526个氨基酸。结构域分析结果显示,ZmCYP72A5在N端含有一个跨膜结构域和一个高度保守的P450超家族结构域,包含的氧结合活性区、PERF区和亚铁血红素结合区三个区域为P450超家族特有的功能结构域。进化树分析发现,玉米CYP72A5与其它植物的CYP72A同源蛋白有不同程度上的亲缘关系,与单子叶植物的CYP72A同源性较高,且与高粱CYP72A15的亲缘关系最近,与双子叶植物的亲缘关系较远。ZmCYP72A5蛋白在玉米原生质体中的亚细胞定位结果...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
玉米开花时间调控网络（Dongetal.,2012）
玉米ZmCYP72A5基因的功能研究12尽管CYPs催化的生物化学反应非常不同，但CYPs在结构折叠上通过相似性联系在一起。一般折叠包括所有CYP和提供底物特异性的结构域特征（Werck-ReichhartandFeyereisen,2000）。如图1-3所示，大多数植物的CYP都有一个膜锚，将它们系在内质网或叶绿体上，然后是一个铰链结构域。每个CYP包含促进与血红素辅因子和细胞色素P450还原酶相互作用的结构域，以及促进与各种底物相互作用的识别位点。血红素结合域是CYP酶家族中最保守的元素，因为它提供半胱氨酸配体，并且具有足够的刚性来将血红素固定在适当的位置供氧化。ExxR区域的谷氨酸和精氨酸残基以及PERF区域的精氨酸在所有的植物CYP中都是保守的，它们似乎能将血红素囊锁在适当的位置，并稳定核心结构（Baketal.,2011）。PERF结构域所在的曲流区对于蛋白质与细胞色素P450还原酶（Sirimetal.,2010）的相互作用也很重要。该i-螺旋包含保守的残基，形成一个质子沟槽，对于裂解O-O键生成活泼的Fe-O羟基化合物至关重要。底物识别位点（SRSs）是在CYP折叠中具有保守位置的高变区域，但其氨基酸功能不同，以适应不同底物大小和化学性质的（Gotoh,1992）。图1-3与功能相关的保守的CYP结构域（Beketal.,2011）Fig.1-3ConservedCYPdomainsrelevanttofunction(Beketal.,2011)1.2.2细胞色素P450功能研究进展CYP450在生物中有两种存在形式，在原核生物中为可溶性蛋白酶；在真核生物中，则锚定于膜结构的细胞器，在细胞质中行使催化功能（Werck-ReichhartandFeyereisen,2000）。多数植物细胞色素P450是内质网结合蛋白，在氨基酸末端通过疏水性螺旋将其锚定在内质网上，其余大部分蛋白位于内质网膜外的胞质面（Chapple,1998）。根据其功能不同可以将CYP450分为两种主要的类型，一
山东农业大学硕士学位论文17pyognenes）的CRISPR/Cas系统是目前应用最多和最成熟的系统（Congetal.,2013；Shanetal.,2013)。CRISPR/CasⅡ型系统的结构见图1-4。图1-4细菌内的CRISPR/Cas系统的工作元件和过程（HavathandBarrangou,2010）Fig.1-4OperatingelementsandprocessesofCRISPR/Cassysteminbacteria(HavathandBarrangou,2010)1.5.2CRISPR/Cas9的应用CRISPR/Cas9系统发展至今已经相对成熟，广泛应用于动植物的细胞基因编辑，研究人员在应用过程中不断改进完善并展开了具有针对性的基因组编辑工作，创制目标突变体，进行基因组功能的研究。CRISPR基因编辑技术被誉为“上帝的手术刀”，提供了一种相对快速且简单的方法，实现对单个基因的精确删除、替换和修改。自2012年问世以来，CRISPR技术在过去几年里不断升级，从基础生物学研究领域到植物育种、新药研发等应用领域，已有广泛的应用。Platt教授领导的研究团队基于CRISPR-Cas的工作原理做了技术创新。CRISPR-Cas技术需要用到核酸酶Cas和起向导作用的小RNA分子。后者的碱基序列相当于一个“地址标签集”，把酶精确地指向染色体上的作用位点。使得我们有可能同时修改细胞内的几十个、乃至上百个基因。迪华农业科技公司借助CRISPR-Cas9技术开发了一种新的玉米性状聚合方法，确定了一系列复合性状目标插入位点（ComplexTraitLoci,CTL），借助CRISPR-Cas9系统以及Bbm和Wus2基因（提高转化效率）在这些CTL区域内分别精准地插入包含筛选标记和FLP重组酶识别位点的外源片段，从而形成多个独立的基因聚合玉米受体。每个受体株系均能够在FLP重组
【参考文献】：
期刊论文
[1]玉米ZmTOC1a、ZmTOC1b基因的克隆、表达及亚细胞定位分析[J]. 蔡云婷,贾力,拓昊苑. 华北农学报. 2019(04)
[2]CRISPR/Cas植物基因组编辑技术研究进展[J]. 刘耀光,李构思,张雅玲,陈乐天. 华南农业大学学报. 2019(05)
[3]细胞色素P450酶在生物合成及有机合成中的催化功能及其应用[J]. 蒋媛媛,李盛英. 有机化学. 2018(09)
[4]基因组编辑技术在水稻功能基因组和遗传改良中的应用[J]. 李希陶,刘耀光. 生命科学. 2016(10)
[5]高等植物抽穗开花调控的分子网络[J]. 穆彩琴,张瑞娟,屈聪玲,齐晓,米怡,杨致荣. 山西农业科学. 2016(08)
[6]植物细胞色素P450s及其在植物新陈代谢中的作用[J]. 李翔宇,王助乾,孙春玉,张美萍,王义. 安徽农业科学. 2016(13)
[7]Efficient Targeted Genome Modification in Maize Using CRISPR/Cas9 System[J]. Chao Feng,Jing Yuan,Rui Wang,Yang Liu,James A.Birchler,Fangpu Han. Journal of Genetics and Genomics. 2016(01)
[8]Journal of Integrative Agriculture[J]. Journal of Integrative Agriculture. 2015(08)
[9]运用CRISPR/Cas系统对植物基因组进行定点编辑[J]. 宋时奎,王影,于洋,耿立召,张春翔,李相敢,韩天富. 分子植物育种. 2014(06)
[10]农杆菌介导超高产大豆子叶节遗传转化研究[J]. 贾钰莹,蒋滢,赵强,谢甫绨,于翠梅. 大豆科学. 2014(05)
硕士论文
[1]3个玉米自交系幼胚转化受体系统建立和CYP735A基因的农杆菌介导转化[D]. 李晓丽.山东农业大学 2011
本文编号：3383447
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
玉米开花时间调控网络（Dongetal.,2012）
玉米ZmCYP72A5基因的功能研究12尽管CYPs催化的生物化学反应非常不同，但CYPs在结构折叠上通过相似性联系在一起。一般折叠包括所有CYP和提供底物特异性的结构域特征（Werck-ReichhartandFeyereisen,2000）。如图1-3所示，大多数植物的CYP都有一个膜锚，将它们系在内质网或叶绿体上，然后是一个铰链结构域。每个CYP包含促进与血红素辅因子和细胞色素P450还原酶相互作用的结构域，以及促进与各种底物相互作用的识别位点。血红素结合域是CYP酶家族中最保守的元素，因为它提供半胱氨酸配体，并且具有足够的刚性来将血红素固定在适当的位置供氧化。ExxR区域的谷氨酸和精氨酸残基以及PERF区域的精氨酸在所有的植物CYP中都是保守的，它们似乎能将血红素囊锁在适当的位置，并稳定核心结构（Baketal.,2011）。PERF结构域所在的曲流区对于蛋白质与细胞色素P450还原酶（Sirimetal.,2010）的相互作用也很重要。该i-螺旋包含保守的残基，形成一个质子沟槽，对于裂解O-O键生成活泼的Fe-O羟基化合物至关重要。底物识别位点（SRSs）是在CYP折叠中具有保守位置的高变区域，但其氨基酸功能不同，以适应不同底物大小和化学性质的（Gotoh,1992）。图1-3与功能相关的保守的CYP结构域（Beketal.,2011）Fig.1-3ConservedCYPdomainsrelevanttofunction(Beketal.,2011)1.2.2细胞色素P450功能研究进展CYP450在生物中有两种存在形式，在原核生物中为可溶性蛋白酶；在真核生物中，则锚定于膜结构的细胞器，在细胞质中行使催化功能（Werck-ReichhartandFeyereisen,2000）。多数植物细胞色素P450是内质网结合蛋白，在氨基酸末端通过疏水性螺旋将其锚定在内质网上，其余大部分蛋白位于内质网膜外的胞质面（Chapple,1998）。根据其功能不同可以将CYP450分为两种主要的类型，一
山东农业大学硕士学位论文17pyognenes）的CRISPR/Cas系统是目前应用最多和最成熟的系统（Congetal.,2013；Shanetal.,2013)。CRISPR/CasⅡ型系统的结构见图1-4。图1-4细菌内的CRISPR/Cas系统的工作元件和过程（HavathandBarrangou,2010）Fig.1-4OperatingelementsandprocessesofCRISPR/Cassysteminbacteria(HavathandBarrangou,2010)1.5.2CRISPR/Cas9的应用CRISPR/Cas9系统发展至今已经相对成熟，广泛应用于动植物的细胞基因编辑，研究人员在应用过程中不断改进完善并展开了具有针对性的基因组编辑工作，创制目标突变体，进行基因组功能的研究。CRISPR基因编辑技术被誉为“上帝的手术刀”，提供了一种相对快速且简单的方法，实现对单个基因的精确删除、替换和修改。自2012年问世以来，CRISPR技术在过去几年里不断升级，从基础生物学研究领域到植物育种、新药研发等应用领域，已有广泛的应用。Platt教授领导的研究团队基于CRISPR-Cas的工作原理做了技术创新。CRISPR-Cas技术需要用到核酸酶Cas和起向导作用的小RNA分子。后者的碱基序列相当于一个“地址标签集”，把酶精确地指向染色体上的作用位点。使得我们有可能同时修改细胞内的几十个、乃至上百个基因。迪华农业科技公司借助CRISPR-Cas9技术开发了一种新的玉米性状聚合方法，确定了一系列复合性状目标插入位点（ComplexTraitLoci,CTL），借助CRISPR-Cas9系统以及Bbm和Wus2基因（提高转化效率）在这些CTL区域内分别精准地插入包含筛选标记和FLP重组酶识别位点的外源片段，从而形成多个独立的基因聚合玉米受体。每个受体株系均能够在FLP重组
【参考文献】：
期刊论文
[1]玉米ZmTOC1a、ZmTOC1b基因的克隆、表达及亚细胞定位分析[J]. 蔡云婷,贾力,拓昊苑. 华北农学报. 2019(04)
[2]CRISPR/Cas植物基因组编辑技术研究进展[J]. 刘耀光,李构思,张雅玲,陈乐天. 华南农业大学学报. 2019(05)
[3]细胞色素P450酶在生物合成及有机合成中的催化功能及其应用[J]. 蒋媛媛,李盛英. 有机化学. 2018(09)
[4]基因组编辑技术在水稻功能基因组和遗传改良中的应用[J]. 李希陶,刘耀光. 生命科学. 2016(10)
[5]高等植物抽穗开花调控的分子网络[J]. 穆彩琴,张瑞娟,屈聪玲,齐晓,米怡,杨致荣. 山西农业科学. 2016(08)
[6]植物细胞色素P450s及其在植物新陈代谢中的作用[J]. 李翔宇,王助乾,孙春玉,张美萍,王义. 安徽农业科学. 2016(13)
[7]Efficient Targeted Genome Modification in Maize Using CRISPR/Cas9 System[J]. Chao Feng,Jing Yuan,Rui Wang,Yang Liu,James A.Birchler,Fangpu Han. Journal of Genetics and Genomics. 2016(01)
[8]Journal of Integrative Agriculture[J]. Journal of Integrative Agriculture. 2015(08)
[9]运用CRISPR/Cas系统对植物基因组进行定点编辑[J]. 宋时奎,王影,于洋,耿立召,张春翔,李相敢,韩天富. 分子植物育种. 2014(06)
[10]农杆菌介导超高产大豆子叶节遗传转化研究[J]. 贾钰莹,蒋滢,赵强,谢甫绨,于翠梅. 大豆科学. 2014(05)
硕士论文
[1]3个玉米自交系幼胚转化受体系统建立和CYP735A基因的农杆菌介导转化[D]. 李晓丽.山东农业大学 2011
本文编号：3383447
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