耐辐射异常球菌黄嘌呤脱氢酶基因在氧化胁迫反应中的作用
发布时间：2021-09-24 11:55
黄嘌呤脱氢酶是嘌呤分解代谢途径的关键酶,具有催化（次）黄嘌呤生成尿酸以及降解醛类化合物的作用,与氮同化、激素代谢、衰老及活性氧产生等过程相关。目前该酶及其编码基因的功能研究主要集中动植物上,而有关微生物黄嘌呤脱氢酶编码基因（xdhABC）的功能,特别是在生物氧化胁迫反应中功能的研究报道甚少。本研究以耐辐射异常球菌为研究对象,通过开展xdhA突变株构建、转录表达分析和分子互作等工作,研究该菌黄嘌呤脱氢酶编码基因xdhA的功能,探讨黄嘌呤脱氢酶基因在氧化胁迫反应中的作用。主要研究进展如下:1.生物信息学结果显示,xdhABC基因位于同一操纵子。同源比较表明,XdhA蛋白与天蓝色链霉菌黄嘌呤脱氢酶蛋白铁硫结合亚基具有71%的相似性（58%Identities）,xdhA基因与xdhB、xdhC基因共同编码功能性黄嘌呤脱氢酶。共转录实验结果进一步证实xdhA、xdhB、xdhC为一个共转录单元。2.为确定xdhABC基因产物具有黄嘌呤脱氢酶特性,本研究构建了xdhA缺失突变株（（35）xdhA）。发现xdhA缺失并不影响菌株在正常培养条件下的生长;腺嘌呤或甲醛毒性实验表明xdhA缺失导致菌株对...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Moco的生物合成途径
中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论5图1-2钼酶三个家族的晶体结构（LEIMKüHLERetal.,2016）Fig.1-2Crystalstructureofthreefamiliesofmolybdenases(LEIMKüHLERetal.,2016)（1）二甲亚砜还原酶家族二甲亚砜还原酶家族（DMSOR）存在于细菌和古菌中，在其活性位点包含一个具有整体化学计量的（Moco）2MoOX钼中心。该钼中心由2当量的Moco辅因子，一个OXO基团（在某些情况下是氢氧根）和一个额外的配体（X，丝氨酸、半胱氨酸、硒半胱氨酸残基）组成（LEIMKüHLERetal.,2016）。这些酶大多催化氧原子转移反应，少数可催化简单的脱氢或氧化还原反应。大多数酶可在厌氧条件下作为末端还原酶，并以各自的辅因子在呼吸代谢中作为末端电子受体。类球红细菌和荚膜红细菌周质的二甲亚砜还原酶（DMSOR，该家族的命名酶）是该家族中第一个具有结构特征的酶（SCHINDELINetal.,1996;SCHNEIDERetal.,1996）。DMSOR广泛存在于各种细菌中，催化二甲基亚砜还原脱氧生成二甲基硫化物（ZHANGetal.,2011）。甲酸脱氢酶（Formatedehydrogenase）是DMSOR家族中另一个广泛存在的成员，催化甲酸盐氧化成碳酸氢盐的反应（JORMAKKAetal.,2003）。DMSOR家族的酶具有反应、功能和结构上的多样性。这些酶可以是只有Mo-bisPGD辅因子的简单可溶性蛋白，如三甲氨基氧化还原酶，二甲亚砜还原酶，生物素亚砜还原酶；也可以是包含Mo-bisPGD的亚基与含血红素的电子转移亚基配对形成的结构更为复杂的酶，如许多真细菌中发现的亚硝酸还原酶（MéJEANetal.,1994;PIERSONetal.,1990;DEMENTINetal.,2007）；甚至是钼亚基作为多亚基膜结合蛋白的一部分而形成的结构更为复杂的酶。随着对酶研究的不断深入，已经对很多二甲亚砜还原酶家族的酶在结构、功能和生物物理水平上进行了鉴定，例如嗜热
UFFetal.,2007;YAMAGUCHIetal.,2007）。1.1.5黄嘌呤脱氢酶催化反应机制黄嘌呤脱氢酶的整个催化序列包括一个还原反应（底物在钼中心被氧化羟基化，并将MoVI还原为MoIV）以及一个分子内电子转移后的氧化反应（其中还原物通过FAD从酶中移除）。在还原反应中，催化是由Mo-OH基团对黄嘌呤C-8的亲核攻击起始的，与此同时氢化物从C-8转移到Mo=S，导致Mo的价态变化（+6–+4）。随后，当Mo从+4价经由+5价的中间态再氧化为+6价时，两个电子依次从Mo位点转移出来，在此过程中，金属结合产物被溶剂中的氢氧化物从钼配位中置换出来（图1-3A）（BRAY,1961）。在氧化反应中，电子从FAD中心传递到末端电子受体NAD+。FADH·或FADH2被NAD+再氧化为FAD。还原后的黄素以半醌或对苯二酚的形式存在，黄素中心有一个电子时以半醌型（FADH·）存在，两个电子时以对苯二酚型（FADH2）存在（图1-3B）（CAO,2011）。图1-3黄嘌呤脱氢酶反应机制。（A）还原反应；（B）氧化反应（CAO,2011）Fig.1-3Reactionmechanismofxanthinedehydrogenase.(A)Reductivereaction;(B)Oxidativereaction(CAO,2011)黄嘌呤脱氢酶催化底物氧化羟基化时涉及氧化还原活性中心间的分子内电子转移过程（图1-4），该转移过程可能涉及电子隧道机制（tunnelingmechanism）（VAN,1976;PAGEetal.,1999）。电子从钼中心转移到[2Fe-2S]I，然后转移到[2Fe-2S]II，最后转移到FAD。催化过程中，酶主要在二电子和四电子的还原态之间循环，其中两个铁硫中心均处于还原态（PRITSOS,2000）。已有研究表明，FAD中心的电子转移与质子耦合电子转移相关，当酶被底物还原后，电子在每个单体内的四个辅因子之间迅速传递。给定中心的相对还原电位越高，还原程度越大（HILLE,1991）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]考马斯亮蓝法测定蛋白质含量中的细节问题[J]. 蒋大程,高珊,高海伦,邱念伟. 实验科学与技术. 2018(03)
[2]细菌小RNA识别研究方法进展[J]. 杨光,郝荣章,邱少富,王勇,薛文仲,宋宏彬,王立贵. 生物物理学报. 2012(01)
[3]沙门菌非编码小RNA调控功能研究进展[J]. 孟霞,王亨,朱国强. 中国兽医学报. 2011(12)
本文编号：3407709
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Moco的生物合成途径
中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论5图1-2钼酶三个家族的晶体结构（LEIMKüHLERetal.,2016）Fig.1-2Crystalstructureofthreefamiliesofmolybdenases(LEIMKüHLERetal.,2016)（1）二甲亚砜还原酶家族二甲亚砜还原酶家族（DMSOR）存在于细菌和古菌中，在其活性位点包含一个具有整体化学计量的（Moco）2MoOX钼中心。该钼中心由2当量的Moco辅因子，一个OXO基团（在某些情况下是氢氧根）和一个额外的配体（X，丝氨酸、半胱氨酸、硒半胱氨酸残基）组成（LEIMKüHLERetal.,2016）。这些酶大多催化氧原子转移反应，少数可催化简单的脱氢或氧化还原反应。大多数酶可在厌氧条件下作为末端还原酶，并以各自的辅因子在呼吸代谢中作为末端电子受体。类球红细菌和荚膜红细菌周质的二甲亚砜还原酶（DMSOR，该家族的命名酶）是该家族中第一个具有结构特征的酶（SCHINDELINetal.,1996;SCHNEIDERetal.,1996）。DMSOR广泛存在于各种细菌中，催化二甲基亚砜还原脱氧生成二甲基硫化物（ZHANGetal.,2011）。甲酸脱氢酶（Formatedehydrogenase）是DMSOR家族中另一个广泛存在的成员，催化甲酸盐氧化成碳酸氢盐的反应（JORMAKKAetal.,2003）。DMSOR家族的酶具有反应、功能和结构上的多样性。这些酶可以是只有Mo-bisPGD辅因子的简单可溶性蛋白，如三甲氨基氧化还原酶，二甲亚砜还原酶，生物素亚砜还原酶；也可以是包含Mo-bisPGD的亚基与含血红素的电子转移亚基配对形成的结构更为复杂的酶，如许多真细菌中发现的亚硝酸还原酶（MéJEANetal.,1994;PIERSONetal.,1990;DEMENTINetal.,2007）；甚至是钼亚基作为多亚基膜结合蛋白的一部分而形成的结构更为复杂的酶。随着对酶研究的不断深入，已经对很多二甲亚砜还原酶家族的酶在结构、功能和生物物理水平上进行了鉴定，例如嗜热
UFFetal.,2007;YAMAGUCHIetal.,2007）。1.1.5黄嘌呤脱氢酶催化反应机制黄嘌呤脱氢酶的整个催化序列包括一个还原反应（底物在钼中心被氧化羟基化，并将MoVI还原为MoIV）以及一个分子内电子转移后的氧化反应（其中还原物通过FAD从酶中移除）。在还原反应中，催化是由Mo-OH基团对黄嘌呤C-8的亲核攻击起始的，与此同时氢化物从C-8转移到Mo=S，导致Mo的价态变化（+6–+4）。随后，当Mo从+4价经由+5价的中间态再氧化为+6价时，两个电子依次从Mo位点转移出来，在此过程中，金属结合产物被溶剂中的氢氧化物从钼配位中置换出来（图1-3A）（BRAY,1961）。在氧化反应中，电子从FAD中心传递到末端电子受体NAD+。FADH·或FADH2被NAD+再氧化为FAD。还原后的黄素以半醌或对苯二酚的形式存在，黄素中心有一个电子时以半醌型（FADH·）存在，两个电子时以对苯二酚型（FADH2）存在（图1-3B）（CAO,2011）。图1-3黄嘌呤脱氢酶反应机制。（A）还原反应；（B）氧化反应（CAO,2011）Fig.1-3Reactionmechanismofxanthinedehydrogenase.(A)Reductivereaction;(B)Oxidativereaction(CAO,2011)黄嘌呤脱氢酶催化底物氧化羟基化时涉及氧化还原活性中心间的分子内电子转移过程（图1-4），该转移过程可能涉及电子隧道机制（tunnelingmechanism）（VAN,1976;PAGEetal.,1999）。电子从钼中心转移到[2Fe-2S]I，然后转移到[2Fe-2S]II，最后转移到FAD。催化过程中，酶主要在二电子和四电子的还原态之间循环，其中两个铁硫中心均处于还原态（PRITSOS,2000）。已有研究表明，FAD中心的电子转移与质子耦合电子转移相关，当酶被底物还原后，电子在每个单体内的四个辅因子之间迅速传递。给定中心的相对还原电位越高，还原程度越大（HILLE,1991）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]考马斯亮蓝法测定蛋白质含量中的细节问题[J]. 蒋大程,高珊,高海伦,邱念伟. 实验科学与技术. 2018(03)
[2]细菌小RNA识别研究方法进展[J]. 杨光,郝荣章,邱少富,王勇,薛文仲,宋宏彬,王立贵. 生物物理学报. 2012(01)
[3]沙门菌非编码小RNA调控功能研究进展[J]. 孟霞,王亨,朱国强. 中国兽医学报. 2011(12)
本文编号：3407709
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