mtDNA和TYR基因在区分貂、狐和貉组织中的应用

发布时间：2021-09-24 13:56

　　水貂、狐狸和貉是重要的毛皮经济动物,近些年来,因具有较高的经济价值而被大量人工饲养。除作为裘皮加工业原材料外,去皮后产生的胴体,由于其价格低廉,时常被非法加工成畜禽产品,对食品安全造成了严重威胁。因此,建立毛皮动物组织的分子鉴别检测技术,对维护毛皮动物产业健康发展具有重要意义。本研究旨在利用Cytb基因从常见肉制品中鉴别貂狐貉组织,并进一步利用TYR和12S rRNA基因对不同品种的水貂进行区分,最后利用mtDNA中D-loop区的差异性对相同品种不同水貂个体进行鉴别。首先,本研究根据GenBank已发表的水貂、狐狸和貉的Cytb基因序列设计了3对特异引物,分别进行PCR扩增及酶切验证,并对各引物的特异性、灵敏度、以及交叉性进行分析。同时,优化退火温度并构建多重PCR,并对其特异性、灵敏度、稳定性进行试验验证。其次,选取水貂的TYR基因和mtDNA中的12S rRNA基因,对三种不同品种的水貂进行基因扩增、回收、测序,并将其结果进行比较分析。第三,选取水貂mtDNA的D-loop区全长设计引物,进行PCR扩增、回收、纯化、克隆、挑菌、测序,随后进行数据分析。结果显示:（1）所建立的多重... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

水貂线粒体基因组结构

mtDNA和TYR基因在区分貂、狐和貉组织中的应用14（9）将吸附柱CB3放回收集管中，12,000g离心2min，弃掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置5min以上，以彻底晾干吸附柱中残留漂洗液中的乙醇；（10）将晾干后的吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加35μL洗脱缓冲液TE，室温放置2min以上，12,000g离心2min，将溶液收集；将提取的DNA模板经Nano-600超微量核酸蛋白测定仪测定，选取浓度>50ng/μL、OD260nm/OD280nm的数值在1.8-2.1之间的DNA模板，放置-20℃冰箱进行保存。2.2.1.2引物设计与合成由于本试验的目的在于建立一个多重PCR检测方法，所以3种毛皮动物的引物设计必须要保障后续试验的成功。在多重PCR中，为保证试验的扩增效率，3对引物扩增条件应相对一致，为下一步试验提供保障。多重PCR的引物在设计在满足普通PCR的条件外，同时也需要注意下面几个方面：①对于该方法主要应对常见肉类中是否掺杂貂狐貉肉，因此设计引物要对比对常见动物与貂、狐和貉cytb基因序列的进行进化树分析（见图2），②各条引物之间不能互补，尤其是形成二聚体；检验是否形成二聚体，需要进行单一PCR扩增。③扩增物种之间的引物序列也不能存在较大的同源性；依据图2结果，对3种毛皮动物和家犬的Cytb基因序列进行比对（见图3）。④各条引物的Tm尽量相同，保证扩增的退火温度一致。⑤各引物扩增的片段大小一定要呈现梯度，而且片段之间的距离要大于200bp以上，来便于观察电泳结果。图210种动物细胞色素b基因进化树分析Fig.2Evolutionarytreeanalysisofcytochromebgenesin10animals

山东农业大学硕士专业学位论文15图3貂、狐、貉和犬Cytb基因序列进行比对结果Fig.3Cytbgenesequencecomparisonofmink,fox,raccoondoganddog根据NCBI已发表的水貂Cytb序列（GenBank：KF990329.1）、狐狸Cytb序列（GenBank：DQ498127.1）、貉Cytb序列（GenBank：JX099889.1），依据图3比对的结果，A、B为水貂上下游引物初始端，C、D为狐狸上下游引物初始端，E、F为貉上下游引物初始端，再根据其他多重PCR扩增条件，利用PrimerPremier6．0软件设计3对特异性引物，引物序列如下表1，由北京六合华大基因有限公司合成；并让其设计且合成一对能够扩增脊椎动物的通用引物；上游引物：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′，下游引物：5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′（1200bp）。

【参考文献】：
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硕士论文
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本文编号：3407875