CRISPR/Cas9编辑NtNINJA基因对低温胁迫下NtJAZ1的表达量的影响

发布时间：2021-10-22 16:04

　　苗期低温会影响普通烟草（Nicotiana tabacum）正常生长发育,导致生长势弱,叶数减少,叶片窄小,烟叶产量和质量降低。前期研究发现,低温胁迫条件下茉莉酸信号途径和合成途径中关键基因表达量上升。NINJA蛋白是茉莉酸信号途径中联系JAZ蛋白与下游转录因子的重要因子,烟草NtNINJA基因和NtJAZ1基因的功能关系并不明晰。CRISPR/Cas9基因编辑技术可运用于基因功能验证。本实验运用CRISPR/Cas9基因编辑技术对普通烟草NtNINJA进行基因编辑,利用荧光定量PCR技术,测定T₀代突变株和野生型植株在低温胁迫和常温条件下NtJAZ1的表达量,了解在NtNINJA基因突变下,NtJAZ1基因表达量差异,为下一步解析NtNINJA突变对NtJAZ1的表达的影响奠定基础。主要结果如下:1.使用靶位点1（F:5-GTTGCAATCCTTAAGGCGTT,R:5-AACGGGTTAA GGATTGCAAC）和靶位点2（F:5-AAAGAACACGTCCTATTAAG,R:5-CTTAA TAGGACGTGTTCTTT）序列作为靶位点能够编辑普通烟草品种红... 

【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 文献综述
    1.1 基因编辑技术
        1.1.1 基因编辑技术简介
        1.1.2 基因编辑技术发展历程
    1.2 CRISPR/Cas系统
        1.2.1 CRISPR/Cas系统的研究历史
        1.2.2 CRISPR/Cas系统的结构
        1.2.3 CRISPR/Cas的分类
        1.2.4 CRISPR/Cas9系统的工作原理
        1.2.5 CRISPR/Cas9基因编辑技术在重要作物中的应用
        1.2.6 CRISPR/Cas9基因编辑技术最新研究进展
    1.3 茉莉酸信号转导途径
        1.3.1 茉莉酸的生物合成
        1.3.2 茉莉酸信号转导途径
        1.3.3 NtNINJA基因和JAZ蛋白家族
    1.4 茉莉酸信号转导途径参与应答低温胁迫
        1.4.1 应答低温胁迫的基因
        1.4.2 茉莉酸提高植物寒冷防御能力
第2章 引言
    2.1 研究的目的与意义
    2.2 研究内容
    2.3 技术路线
第3章 CRISPR/Cas9编辑烟草NtNINJA基因
    3.1 材料与方法
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 菌株与载体
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 植物组织培养培养基配方
        3.1.5 大肠杆菌培养培养基配方
        3.1.6 农杆菌培养培养基配方
        3.1.7 主要试剂溶液
        3.1.8 引物
    3.2 表达载体构建
        3.2.1 pCACas9骨架载体的获得
        3.2.2 sgRNA质粒的获得
        3.2.3 靶位点设计、选择
        3.2.4 靶位点的sgRNA组装
        3.2.5 sgRNA插入pCACas9骨架载体
        3.2.6 表达载体转化农杆菌
    3.3 烟草的遗传转化
        3.3.1 烟草无菌苗的获得
    3.4 突变体筛选及检测
        3.4.1 CTAB法提取烟草基因组DNA
        3.4.2 突变体筛选
        3.4.3 突变类型的测定
    3.5 结果与分析
        3.5.1 pCACas9-NtNINJA-AB表达载体的构建
        3.5.2 烟草遗传转化
        3.5.3 CRISPR/Cas9编辑烟草NtNINJA基因的T0代转基因植株NtNINJA基因突变情况分析
    3.6 本章小结
第4章 NtNINJA基因碱基缺失烟草植株的克隆与序列分析
    4.1 材料
    4.2 方法
        4.2.1 突变型NtNINJA引物设计
        4.2.2 总RNA的提取
        4.2.3 逆转录成cDNA
        4.2.4 PCR扩增
        4.2.5 目的基因胶回收
        4.2.6 连接与转化
        4.2.7 重组质粒的检测与测序
        4.2.8 生物信息学分析
    4.3 结果分析
        4.3.1 烟草总RNA的提取检测
        4.3.2 突变型NtNINJA的PCR扩增与胶回收
        4.3.3 突变型NtNINJA的菌液PCR检测
        4.3.4 突变NtNINJA序列生物信息学分析
    4.4 本章小结
第5章 低温条件下NtNINJA基因突变型烟草茉莉酸途径关键基因NtJAZ1的定量表达分析
    5.1 材料
    5.2 方法
        5.2.1 材料处理
        5.2.2 取样
        5.2.3 总RNA的提取
        5.2.4 逆转录成cDNA
        5.2.5 引物设计
        5.2.6 定量PCR扩增
    5.3 结果分析
        5.3.1 提取RNA的检测
        5.3.2 NtJAZ1在不同处理中的表达量分析
    5.4 本章小结
第6章 结论与讨论
    6.1 结论
        6.1.1 SgRNA/Cas9编辑红大NtNINJA基因
        6.1.2 突变NtNINJA基因的克隆及生物信息学分析
        6.1.3 低温胁迫NtNINJA基因突变型烟草NtJAZ1的定量表达分析
    6.2 讨论
参考文献
附录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]谷子SiARGOS1的克隆、表达分析和功能标记开发[J]. 王智兰,杜晓芬,王军,杨慧卿,王兴春,郭二虎,王玉文,袁峰,田岗,刘鑫,王秋兰,李会霞,张林义,彭书忠.  中国农业科学. 2017(22)
[2]基于CRISPR/Cas9系统的水稻光敏色素互作因子OsPIL15基因编辑[J]. 季新,李飞,晏云,孙红正,张静,李俊周,彭廷,杜彦修,赵全志.  中国农业科学. 2017(15)
[3]基于CRISPR/Cas9技术的水稻转录因子tify1a和tify1b突变体的创建与分析[J]. 黄小贞,曾晓芳,李建容,赵德刚.  农业生物技术学报. 2017(06)
[4]张锋团队发布CRISPR全新诊断系统[J]. 聂翠蓉.  科学观察. 2017(02)
[5]CRISPR/Cas9在烟草遗传育种中的应用[J]. 张之矾,周红江,冯厚平,刘明竞,侯军,芶剑渝.  安徽农业科学. 2016(22)
[6]基于CRISPR/Cas9技术的烟草NtDXR基因敲除及功能分析[J]. 聂梦云,高军平,罗培,陈晓乐,易小慧,王根洪,夏庆友.  烟草科技. 2016(06)
[7]基于CRISPR/Cas9技术的水稻千粒重基因tgw6突变体的创建[J]. 王加峰,郑才敏,刘维,罗文龙,王慧,陈志强,郭涛.  作物学报. 2016(08)
[8]玉米耐盐基因ZmHKT1的序列变异分析[J]. 姜志磊,姜昱,刘艳芝,蒋超,金峰学,李毅丹.  玉米科学. 2015(05)
[9]应用CRISPR/Cas9技术在杨树中高效敲除多个靶基因[J]. 刘婷婷,范迪,冉玲玉,姜渊忠,刘瑞,罗克明.  遗传. 2015(10)
[10]Genome-wide association analyses provide genetic and biochemical insights into natural variation in rice metabolism[J].   Science Foundation in China. 2014(02)

博士论文
[1]利用TALENs和CRISPR/Cas9基因编辑技术改良水稻稻瘟病抗性[D]. 王福军.广西大学 2016



本文编号：3451431