枣黑斑病菌SSN3、SSN8、MED12和MED13基因功能初步研究

发布时间：2021-10-30 21:27

　　枣树是中国第一大干果树种,也是重要的药用和经济林作物。真菌病害严重影响了枣产量与品质,其中链格孢（Alternaria alternata）是引起枣果实病害的重要病原,能够导致多种症状,如枣黑斑、枣褐皮、枣缩果等我们以其典型代表症状将该病害命名为枣黑斑病。2015年,链格孢（A.alternata）全基因组数据的公布,为其基因功能的定点研究、互作机制、致病机理等的研究奠定了基础。本文采用重叠PCR技术,利用原生质体转化的方法,将目的基因替换为潮霉素抗性基因hyg,敲除了枣黑斑病菌中编码CDK8激酶模块的SSN3、SSN8、MED12和MED13这四个蛋白的基因,通过报告基因表达的抗性筛选及PCR检测,分别获得了这四个蛋白编码基因的缺失突变体,同时还得到了这四个编码基因缺失突变体的回补菌株。通过对以上缺失突变体及其回补菌株的表型分析发现:1)Ssn3基因缺失后,菌株生长受抑制,几乎无气生菌丝,产孢量显著下降（-98.56%）,孢子链变短,无分支,只有1～3个分生孢子串生;Ssn3基因缺失菌株在PDA培养基上菌落比野生型的颜色深,呈黑色,生长变慢,且对过氧化氢、氯化钠及SDS的压力胁迫比较... 

【文章来源】：河南农业大学河南省

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
摘要
1 文献综述
    1.1 枣黑斑病病害概述
    1.2 链格孢Alternaria alternata致病机理研究
        1.2.1 毒素合成相关基因
        1.2.2 机械穿透作用
        1.2.3 降解酶与Alternaria真菌致病性
        1.2.4 信号转导基因
    1.3 中介体复合体(Mediator complex)的CDK8激酶模块研究
        1.3.1 中介体复合体(Mediator complex)
        1.3.2 CDK8激酶模块(CKM)
2 引言
3 材料与方法
    3.1 试验材料
        3.1.1 菌株
        3.1.2 培养基
        3.1.3 试剂
        3.1.4 仪器
    3.2 试验方法
        3.2.1 基因组DNA提取
        3.2.2 pCB1003质粒的提取
        3.2.3 枣黑斑病菌的Ssn3、Ssn8、Med12、Med13基因DNA序列的获得
        3.2.4 基因敲除盒的构建
            3.2.4.1 基因敲除盒的引物设计
            3.2.4.2 Ssn3、Ssn8、 Med12、 Med13基因上下片段的获得
        3.2.5 原生质体的制备及转化
        3.2.6 突变体的筛选
        3.2.7 缺失突变体的验证
            3.2.7.1 转化子DNA粗提
            3.2.7.2 转化子检测引物设计
        3.2.8 缺失突变体回补敲除盒的构建
            3.2.8.1 基因缺失突变体回补策略
            3.2.8.2 突变体原生质体制备
            3.2.8.3 突变体回补及其检测引物的设计
            3.2.8.4 缺失突变体回补菌株的PCR验证
        3.2.9 突变体菌落表型观察及生长速度测量
        3.2.10 突变体产孢率测定
        3.2.11 突变体产孢情况观察
        3.2.12 突变体耐压性测定
        3.2.13 突变体对冬枣的致病性
        3.2.14 突变体对梨的致病性
4 结果与分析
    4.1 蛋白序列的分析鉴定
    4.2 基因敲除盒的构建结果
        4.2.1 潮霉素片段的获得
        4.2.2 Ssn3基因敲除盒的获得
        4.2.3 Ssn8基因敲除盒的获得
        4.2.4 Med12与Med13基因敲除盒的获得
    4.3 转化子的检验结果
        4.3.1 Ssn3基因的转化子检验结果
        4.3.2 Ssn8基因的转化子检验结果
        4.3.3 Med12基因的转化子检验结果
        4.3.4 Med13基因的转化子检验结果
    4.4 缺失突变体的回补
        4.4.1 Ssn3基因缺失突变体的回补
        4.4.2 Ssn8基因缺失突变体的回补
        4.4.3 Med12基因缺失突变体的回补
        4.4.4 Med13基因缺失突变体的回补
    4.5 Ssn3,Ssn8,Med12和Med13基因功能分析
        4.5.1 缺失突变体的营养生长情况
        4.5.2 缺失突变体产分生孢子的情况
        4.5.3 缺失突变体在不同压力胁迫下耐受性
        4.5.4 缺失突变体对枣和梨果实的致病力
5. 结论与讨论
    5.1 结论
    5.2 讨论
参考文献
Abstract


【参考文献】：
期刊论文
[1]子宫肌瘤患者MED12高频突变对细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响[J]. 吴娟,张子宇,邹阳,罗勇,黄欧平.  现代妇产科进展. 2018(02)
[2]我国枣主产区发展现状及土地可持续利用分析[J]. 宁强.  中国农业资源与区划. 2016(07)
[3]链格孢菌毒素合成相关基因研究进展[J]. 王洪秀,张倩,王玲杰,唐科志.  中国生物工程杂志. 2015(11)
[4]芸薹链格孢菌孢子萌发及附着胞形成的初步定量研究[J]. 马海霞,刘影,屈直,李丹,杨毅,杨信东.  吉林农业大学学报. 2013(04)
[5]枣树内生真菌的分离、鉴定及其多样性分析[J]. 李冬霞,武海燕,张猛,陈谟林,宋宏伟.  果树学报. 2010(06)
[6]壶瓶枣褐斑病病原菌的鉴定[J]. 于占晶,侯晓杰,崔建州,冉隆贤,吕小红.  植物病理学报. 2010(01)
[7]链格孢菌原生质体的制备与限制性内切酶介导整合（REMI）转化的致病性诱变[J]. 伏建国,强胜,朱云枝.  菌物学报. 2005(03)
[8]金丝小枣果实病害病原菌研究[J]. 张立震,康绍兰,刘春琴,孙玉英,黄素芳.  林业科学. 2004(06)
[9]沾化冬枣果实病害的发生与生态相关性研究初报[J]. 辛玉成,王贵禧,崔卫东,王海,郭树河,缪建平.  莱阳农学院学报. 2003(04)
[10]链格孢菌寄主选择性毒素的研究现状[J]. 万佐玺,强胜,李扬汉.  湖北民族学院学报(自然科学版). 2001(04)

博士论文
[1]玉米小斑病菌中Vel2与Vos1的功能分析[D]. 王伟伟.吉林大学 2014
[2]枣树农艺性状遗传多样性评价与核心种质构建[D]. 董玉慧.河北农业大学 2008
[3]链格孢属真菌现代分类方法研究[D]. 孙霞.山东农业大学 2006

硕士论文
[1]枣果实病原真菌的鉴定及链格孢属病原真菌多样性研究[D]. 王叶.河南农业大学 2013
[2]禾谷镰刀菌AMT1基因的功能研究[D]. 王光辉.西北农林科技大学 2010
[3]冬枣黑点病病原物分子鉴定与致病机理初探[D]. 于丽娜.河北农业大学 2007
[4]葱紫斑病重要流行环节及综合防治技术的初步研究[D]. 温嘉伟.吉林农业大学 2007
[5]中国部分枣产区枣主要果实病害的病原及药剂筛选[D]. 况红玲.北京林业大学 2007
[6]我国部分区域链格孢属（Alternaria Nees）真菌的资源调查与形态和分子鉴定研究[D]. 谢红艳.贵州大学 2006
[7]金丝小枣浆烂果病病原、发病规律及防治[D]. 刘春琴.河北农业大学 2002



本文编号：3467459