圆红冬孢酵母CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立

发布时间：2021-10-31 00:27

　　圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）是一种典型的产油酵母,能在多种营养元素限制下产油脂,另外还可合成类胡萝卜素。但是作为非模式酵母,圆红冬孢酵母的遗传操作平台还很不成熟。本研究主要在R.toruloides NP11（简称Rt NP11）中建立CRISPR/Cas9基因编辑系统,为遗传改造提供技术手段。通过农杆菌介导转化法将内源二酯酰甘油酰基转移酶基因DGAT2（Diacylglycerol acyltransferase）转入Rt NP11菌株中,得到过表达DGAT2的菌株Rt NP11-DGAT2,比较评价细胞油脂含量的变化。在此转化方法基础上,从Rt NP11基因组中克隆RNA聚合酶III启动子U6,从Rt NP11基因组中鉴定tRNA^Gly基因,U6与tRNA^Gly基因融合形成人工杂合启动子U6-tRNAGly。合成密码子优化的Cas9基因,Cas9表达元件与gRNA转录元件通过Gibson方法连接到质粒框架,以类胡萝卜素合成途径中的关键基因—八氢番茄红素脱氢酶基因CRT1为CRISPR编辑的验证靶点,2... 

【文章来源】：青岛大学山东省

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 圆红冬孢酵母概述
        1.1.1 圆红冬孢酵母的分类地位和生理特征
        1.1.2 圆红冬孢酵母应用研究进展
    1.2 微生物油脂概述
        1.2.1 微生物油脂的概念和特点
        1.2.2 二酰甘油酰基转移酶(DGAT)在油脂合成中的作用
        1.2.3 DGAT在油脂合成中的应用
    1.3 圆红冬孢酵母遗传工程研究进展
        1.3.1 圆红冬孢酵母遗传转化方法
        1.3.2 圆红冬孢酵母遗传表达系统研究概况
    1.4 CRISPR/Cas9 基因编辑系统在遗传操作中的应用
        1.4.1 CRISPR/Cas9 基因编辑系统概述
        1.4.2 CRISPR/Cas9 基因编辑系统的应用
    1.5 本文研究思路
第二章 圆红冬孢酵母遗传转化方法的建立
    2.1 引言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 菌株和质粒
        2.2.2 引物
        2.2.3 试剂
        2.2.4 仪器和设备
        2.2.5 培养基
        2.2.6 RNA提取
        2.2.7 RNA反转录
        2.2.8 聚合酶链式反应(PCR)
        2.2.9 PCR产物纯化
        2.2.10 重组质粒的构建
        2.2.11 重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞
        2.2.12 重组质粒的提取
        2.2.13 重组质粒酶切验证
        2.2.14 E.coli菌种的保藏与测序
        2.2.15 重组质粒转化农杆菌AGL1 感受态细胞
        2.2.16 农杆菌菌落PCR鉴定
        2.2.17 农杆菌菌种的保藏
        2.2.18 农杆菌与酵母共培养
        2.2.19 圆红冬孢酵母基因组提取
        2.2.20 酵母转化子的鉴定和保藏
        2.2.21 生长曲线的测定
        2.2.22 油脂的提取
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 质粒酶切验证结果分析
        2.3.2 农杆菌PCR验证结果分析
        2.3.3 酵母转化子鉴定结果分析
        2.3.4 过表达DGAT2 基因对Rt NP11 油脂合成的影响
    2.4 本章小结
第三章 圆红冬孢酵母CRISPR/Cas9 基因编辑系统的构建
    3.1 引言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 菌株和质粒
        3.2.2 引物
        3.2.3 聚合酶链式反应(PCR)
        3.2.4 重组质粒的构建
        3.2.5 免疫印迹(Western Blot)
        3.2.6 酵母转化子的测序
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 质粒酶切验证结果分析
        3.3.2 农杆菌PCR验证结果分析
        3.3.3 酵母转化子Cas9 蛋白表达检测
        3.3.4 酵母转化子鉴定结果分析
        3.3.5 酵母转化子测序结果
    3.4 本章小结
第四章 gRNA启动子对圆红冬孢酵母基因编辑效率的影响
    4.1 引言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 菌株和质粒
        4.2.2 引物
        4.2.3 聚合酶链式反应(PCR)
        4.2.4 重组质粒的构建
        4.2.5 酵母转化子的鉴定和测序
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 质粒酶切验证结果分析
        4.3.2 农杆菌PCR验证结果分析
        4.3.3 酵母转化子表型鉴定
        4.3.4 酵母转化子测序结果
        4.3.5 四种gRNA启动子的基因编辑效率比较
        4.3.6 温度对基因编辑效率的影响
    4.4 本章小结
第五章 切割位点对圆红冬孢酵母基因编辑效率的影响
    5.1 引言
    5.2 材料和方法
        5.2.1 菌株和质粒
        5.2.2 引物
        5.2.3 聚合酶链式反应(PCR)
        5.2.4 重组质粒的构建
        5.2.5 酵母转化子的鉴定与测序
    5.3 结果与分析
        5.3.1 质粒酶切验证结果分析
        5.3.2 酵母转化子表型鉴定
    5.4 本章小结
第六章 结论和展望
    6.1 结论
    6.2 展望
参考文献
攻读学位期间的研究成果
附录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]利用CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌tnaA基因[J]. 何京桦,乐科易.  生物学杂志. 2019(06)
[2]CRISPR/Cas9技术在基因功能研究中的应用[J]. 周芮,张辟.  生物化工. 2019(01)
[3]CRISPR/Cas9介导柑橘CsLOB1基因启动子的多位点编辑[J]. 邹修平,范迪,彭爱红,何永睿,许兰珍,雷天刚,姚利晓,李强,罗克明,陈善春.  园艺学报. 2019(02)
[4]应用CRISPR/cas9系统敲除HIF1α基因抑制前列腺癌DU145细胞的增殖和侵袭[J]. 许云屹,徐苗,张孟尼,谭珺娅,苏征征,陈雪芹,周桥.  中华医学遗传学杂志. 2018 (02)
[5]番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立[J]. 蒲艳,刘超,李继洋,阿尔祖古丽·塔什,胡燕,刘晓东.  中国农业科学. 2018(02)
[6]虾青素来源及生物活性的研究进展[J]. 吕亭亭,刘海丽,冯晓慧,葛声.  中国食物与营养. 2016(07)
[7]CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展[J]. 李聪,曹文广.  生物工程学报. 2015(11)
[8]植物I型二酰甘油酰基转移酶研究进展[J]. 王安可,孙英超,何秋伶,潘晶晶,李书霞,祝水金,陈进红.  中国油料作物学报. 2014(02)
[9]β-胡萝卜素的研究进展及应用[J]. 王丽娟,张慧,张立冬,张万青,张伟,王延霞,田浩.  中国食品添加剂. 2013(S1)
[10]番茄红素的生理保健功能及应用研究进展[J]. 刘蕊,朱希强.  食品与药品. 2013(05)

博士论文
[1]基于农杆菌介导的圆红冬孢酵母遗传重组系统的研究[D]. 孙文怡.大连理工大学 2017

硕士论文
[1]高产类胡萝卜素的红酵母突变菌株筛选及其性能研究[D]. 高宁.大连工业大学 2017
[2]产油酵母圆红冬孢酵母二酰甘油酰基转移酶的鉴定和性质研究[D]. 王珍.江南大学 2016
[3]圆红冬孢酵母类胡萝卜素生产途径的诱变改造及代谢分析[D]. 刘妍.大连工业大学 2016
[4]圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）21167菌株产油脂的研究[D]. 王琦.中国海洋大学 2012



本文编号：3467698