大肠杆菌mazG基因参与mazEF介导的严紧反应调控
发布时间：2021-11-02 01:49
目的探索mazG基因参与调控mazEF毒素-抗毒素系统（TAs）介导的细菌生长抑制与程序性死亡的分子机制,明确MazG蛋白真正的生理功能。方法以大肠杆菌MC4100为原型,通过relA基因的回复突变,获得relA野生型的菌株MC4200。通过同源重组的方法,构建大肠杆菌mazG、mazEF、mazEFG基因敲除菌株,测试mazG基因在不同基因背景菌株中过表达对细菌存活率的影响;通过rifampicin、H2O2及serine hydroxamate（SHT）等胁迫条件处理细菌,研究mazG及mazEFG操纵子缺失菌株的生长曲线与存活率;克隆大肠杆菌mazG基因,构建诱导型过表达质粒pET28a-mazG及突变体pET28a-mazG E38A,在BL21菌株中表达纯化MazG蛋白,通过酶学实验验证了MazG蛋白的去磷酸酶活性;测试突变体过表达对细菌存活率的影响。结果 mazG过表达对大肠杆菌MC4200的生长无显著影响,但对mazEFG基因敲除株具有显著抑制作用;MazG的细胞毒性依赖于其NTP-PPase酶活性;mazEF的存在会显著抑制m...
【文章来源】：国际药学研究杂志. 2020,47(08)北大核心
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
不同物种来源MazG蛋白的序列比对注：VWQ04633.1：大肠杆菌；CNG39363.1：结核分枝杆菌；ACN47095.1：沙门氏菌；CYB76634.1：金黄色葡萄球菌
为探究基因maz EFG操纵子对细菌正常生长造成的影响，本文对大肠杆菌MC4100菌株进行了rel A基因的回复突变，构建了MC4200菌株，使其获得正常的严紧反应能力。在此基础上，构建了MC4200的maz EF、maz G、maz EFG基因敲除菌株，分别标识为4200、4200△EF、4200△G和4200△EFG。文献表明[10],maz G基因在大肠杆菌maz EFG敲除菌株中过表达会显著抑制大肠杆菌的生长。为进一步探究maz G的细胞毒性与maz EF的关系及其对细菌生存率的影响，我们分别向MC4200和MC4200△EFG菌株转入构建好的p BAD33-maz G载体，将阳性转化菌株分别命名为4200G和4200G△EFG。通过添加阿拉伯糖诱导Maz G蛋白的表达，观察其对菌株生存率的影响。结果显示4200G△EFG菌株过表达maz G时，其生长速度（G=1.757±0.001495,n=3）明显低于未添加Arab的4200G△EFG菌株（P<0.01），该结果与文献结果[10]吻合（图1）。但引人注意的是，在4200G菌株过表达maz G时，生长速度（G=1.246±0.001633,n=3）则与未添加Arab时4200G菌株无明显差异（图1）。这说明maz G基因过表达时，显著抑制了细胞的正常生长，且这种细胞毒性与maz EF密切相关。这一结果表明，maz EFG操纵子作为一个整体共同发挥作用，它们在调控细菌生长抑制与凋亡中具有协同效应，maz EF基因对maz G可能具有负调控作用。2.2 Maz G的细胞毒性依赖于其d NTP焦磷酸水解酶活性
图2 不同物种来源MazG蛋白的序列比对注：VWQ04633.1：大肠杆菌；CNG39363.1：结核分枝杆菌；ACN47095.1：沙门氏菌；CYB76634.1：金黄色葡萄球菌为排除极化效应对实验结果的影响，在MC4200、MC4200△maz G及MC4200△EFG菌株中转入p BAD-maz G质粒，对应菌株标记为MC4200G、MC4200G△maz G及MC4200G△maz EFG。通过加入Ara诱导maz G基因的表达以回补Maz G，比较回补菌株与野生型菌株在10μg/ml利福平刺激下的存活率。Western印迹法结果表明（图8），阿拉伯糖的加入成功诱导了Maz G的表达（携带6*His标签，图8B）。maz G基因回补后，MC4200菌株和MC4200△G菌株与野生型菌株无显著差异，这说明maz G的敲除并未影响其上游maz EF的表达，未产生“极化效应”。而MC4200△EFG在Maz G回补后，细菌存活率会显著低于野生型菌株（P<0.01），这是由于maz G的活性所致，该结果与本文图1结果及文献[11]结果吻合。
【参考文献】：
期刊论文
[1]毒素-抗毒素系统及其典型模型研究进展[J]. 熊建伟,杜现礼,车永胜,陈依军. 药物生物技术. 2017(05)
本文编号：3471107
【文章来源】：国际药学研究杂志. 2020,47(08)北大核心
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
不同物种来源MazG蛋白的序列比对注：VWQ04633.1：大肠杆菌；CNG39363.1：结核分枝杆菌；ACN47095.1：沙门氏菌；CYB76634.1：金黄色葡萄球菌
为探究基因maz EFG操纵子对细菌正常生长造成的影响，本文对大肠杆菌MC4100菌株进行了rel A基因的回复突变，构建了MC4200菌株，使其获得正常的严紧反应能力。在此基础上，构建了MC4200的maz EF、maz G、maz EFG基因敲除菌株，分别标识为4200、4200△EF、4200△G和4200△EFG。文献表明[10],maz G基因在大肠杆菌maz EFG敲除菌株中过表达会显著抑制大肠杆菌的生长。为进一步探究maz G的细胞毒性与maz EF的关系及其对细菌生存率的影响，我们分别向MC4200和MC4200△EFG菌株转入构建好的p BAD33-maz G载体，将阳性转化菌株分别命名为4200G和4200G△EFG。通过添加阿拉伯糖诱导Maz G蛋白的表达，观察其对菌株生存率的影响。结果显示4200G△EFG菌株过表达maz G时，其生长速度（G=1.757±0.001495,n=3）明显低于未添加Arab的4200G△EFG菌株（P<0.01），该结果与文献结果[10]吻合（图1）。但引人注意的是，在4200G菌株过表达maz G时，生长速度（G=1.246±0.001633,n=3）则与未添加Arab时4200G菌株无明显差异（图1）。这说明maz G基因过表达时，显著抑制了细胞的正常生长，且这种细胞毒性与maz EF密切相关。这一结果表明，maz EFG操纵子作为一个整体共同发挥作用，它们在调控细菌生长抑制与凋亡中具有协同效应，maz EF基因对maz G可能具有负调控作用。2.2 Maz G的细胞毒性依赖于其d NTP焦磷酸水解酶活性
图2 不同物种来源MazG蛋白的序列比对注：VWQ04633.1：大肠杆菌；CNG39363.1：结核分枝杆菌；ACN47095.1：沙门氏菌；CYB76634.1：金黄色葡萄球菌为排除极化效应对实验结果的影响，在MC4200、MC4200△maz G及MC4200△EFG菌株中转入p BAD-maz G质粒，对应菌株标记为MC4200G、MC4200G△maz G及MC4200G△maz EFG。通过加入Ara诱导maz G基因的表达以回补Maz G，比较回补菌株与野生型菌株在10μg/ml利福平刺激下的存活率。Western印迹法结果表明（图8），阿拉伯糖的加入成功诱导了Maz G的表达（携带6*His标签，图8B）。maz G基因回补后，MC4200菌株和MC4200△G菌株与野生型菌株无显著差异，这说明maz G的敲除并未影响其上游maz EF的表达，未产生“极化效应”。而MC4200△EFG在Maz G回补后，细菌存活率会显著低于野生型菌株（P<0.01），这是由于maz G的活性所致，该结果与本文图1结果及文献[11]结果吻合。
【参考文献】：
期刊论文
[1]毒素-抗毒素系统及其典型模型研究进展[J]. 熊建伟,杜现礼,车永胜,陈依军. 药物生物技术. 2017(05)
本文编号：3471107
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3471107.html
最近更新
教材专著
