CEMP1基因修饰骨髓基质细胞膜片对骨质疏松大鼠牙周组织再生的作用研究
发布时间：2021-11-05 18:17
目的:以携带牙骨质蛋白1（cementum protein 1,CEMP1）基因的慢病毒LV-CEMP1-EGFP转染大鼠骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）并构建细胞膜片,探讨CEMP1基因修饰的BMSCs细胞膜片对骨质疏松状态下牙周组织再生的作用。方法:1.全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,使用流式细胞术检测其表面标志物,经成骨、成脂诱导后观察细胞的多向分化能力。2.使用维生素C连续诱导法构建BMSCs细胞膜片,通过组织学染色以及扫描电镜观察膜片的结构。使用免疫荧光染色检测膜片胞外基质Ι型胶原（collagen typeΙ,Col-Ι）、骨膜蛋白（periostin,PN）和纤维连接蛋白（fibronectin,FN）的表达。3.使用携带CEMP1基因的慢病毒LV-CEMP1-EGFP转染BMSCs并构建细胞膜片,流式细胞术检测转染效率,RT-PCR和Western Blot检测转染后BMSCs膜片中CEMP1基因和蛋白的表达。4.采用双侧卵巢切除术构建大鼠绝经后骨质疏松（postmenopausal osteoporosis,PMO...
【文章来源】：福建医科大学福建省
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
大鼠BMSCs体外培养形态学观察A：BMSCs原代培养5d；B：BMSCs原代培养10d；标尺：500μm
17图1-2BMSCs多向分化能力检测A：BMSCs成骨诱导显微镜下观；B：BMSCs成脂诱导显微镜下观；C：BMSCs成骨诱导显微镜下观；D：BMSCs成骨诱导矿化结节茜素红染色；E：BMSCs成脂诱导脂滴油红O染色；F：BMSCs成骨诱导ALP染色；标尺：300μm。3.BMSCs表面标志物检测使用流式细胞仪对BMSCs表面标志物CD29、CD31、CD45、CD34、CD105和CD90进行检测，结果发现BMSCs中，CD29、CD90和CD105阳性表达，表达率分别为86.1%、93.7%和81.9%，CD31、CD45和CD34阴性表达，表达率为6.4%、1.4%和1.1%（图1-3）。图1-3流式细胞术鉴定BMSCs表面标志物3.BMSCs膜片观察和膜片细胞死活荧光染色BMSCs经膜片诱导液诱导10d左右，可见6孔板底部出现一层半透明的膜状结构，边缘卷曲（图1-4A），使用细胞刮刀沿边缘卷曲处小心刮起可完整获得细胞膜片。膜片呈乳白色半透明膜状，收缩明显，边缘卷曲形态不规则，所构建的膜片具有一定的弹性（图1-4B）。膜片诱导液诱导10d左右，可见BMSCs复层生长排列致密且成极性排列，富含细胞外基质（图1-4C）。细胞死活荧光染色结果显示膜片中红染的死亡细胞较少，主要由大量绿染的具有活力的细胞构成（图1-4D）。
18图1-4BMSCs膜片观察和膜片细胞死活荧光染色A：BMSCs膜片边缘卷曲；B：BMSCs膜片刮起后形态；C：BMSCs膜片显微镜下观；D：BMSCs膜片细胞死活荧光染色；标尺：200μm。5.BMSCs膜片的组织学观察BMSCs膜片HE染色显示膜片由3-4层细胞及细胞外基质组成，厚约30-40μm左右，细胞核呈蓝紫色，细胞外基质呈红色，细胞重叠排列界限不清（图1-5A、C）。Masson染色可见细胞通过胶原纤维紧密连接，富含胞外基质（图1-5B、D）。图1-5BMSCs膜片的组织学观察A：BMSCs膜片HE染色（标尺：60μm）；B：BMSCs膜片Masson染色（标尺：60μm）；C：BMSCs膜片HE染色（标尺：20μm）；D：BMSCs膜片Masson染色（标尺：20μm）.
【参考文献】：
期刊论文
[1]环孢素A联合牙龈卟啉单胞菌脂多糖局部应用对大鼠牙周组织缺损修复影响研究[J]. 黄美香,闫福华. 中国实用口腔科杂志. 2018(07)
[2]骨质疏松大鼠骨髓基质细胞膜片的体外构建研究[J]. 何梦娇,江俊,郑宝玉,许雄程,吴玉铭,林敏魁,陈玉玲,骆凯. 中国骨质疏松杂志. 2017(08)
[3]大黄素对骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性再灌注肾损伤的影响[J]. 李忠. 中国组织工程研究. 2016(14)
[4]骨髓间充质干细胞移植改善糖尿病肾病大鼠血糖及尿总蛋白[J]. 杜俊文,吴韬,张坤,苏白玉,卢彩萍,王伟超,雷琳,郭静霞. 中国组织工程研究. 2016(06)
[5]自体骨髓间充质干细胞移植辅助高压氧治疗高血压脑出血临床观察[J]. 张化明,杨冰. 中国实用神经疾病杂志. 2014(21)
[6]骨缺损修复生物工程研究进展[J]. 郭宜姣,李文华. 中国骨质疏松杂志. 2014(08)
[7]经皮自体骨髓间充质干细胞移植术治疗四肢骨折骨不连41例[J]. 张传开,史跃,刘英,冯晖,赵日光,刘军权. 山东医药. 2012(02)
[8]可注射性纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合骨髓间充质干细胞促进骨缺损的修复[J]. 刘阳,朱立新,杨宏,田京,许勇,于博,李志浩,冯庆玲,黄智. 中国组织工程研究与临床康复. 2010(34)
[9]人骨形成蛋白-7基因转染犬骨髓基质细胞促进牙周组织再生的实验研究[J]. 李艳芬,闫福华,钟泉,赵欣. 中华医学杂志. 2010 (20)
[10]增强型绿色荧光蛋白标记技术对骨折后骨髓间充质干细胞的迁移示踪[J]. 段小军,杨柳,周跃,辛榕,李起鸿. 中国修复重建外科杂志. 2006(02)
博士论文
[1]瘦素基因修饰组织工程化复合物对骨质疏松状态下牙周组织再生的作用研究[D]. 郑宝玉.福建医科大学 2015
[2]骨髓基质干细胞与牙周膜干细胞膜片在牙周组织再生的实验研究[D]. 唐雪鹏.第四军医大学 2012
硕士论文
[1]大鼠骨髓基质细胞体外培养及CEMP1基因转染研究[D]. 吴玉铭.福建医科大学 2018
[2]免疫磁珠分离人骨髓基质干细胞的实验研究[D]. 李静.东南大学 2006
[3]兔BMSCs体外培养及定向诱导为脂肪细胞、成骨细胞的研究[D]. 李雅娜.昆明医学院 2005
本文编号：3478277
【文章来源】：福建医科大学福建省
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
大鼠BMSCs体外培养形态学观察A：BMSCs原代培养5d；B：BMSCs原代培养10d；标尺：500μm
17图1-2BMSCs多向分化能力检测A：BMSCs成骨诱导显微镜下观；B：BMSCs成脂诱导显微镜下观；C：BMSCs成骨诱导显微镜下观；D：BMSCs成骨诱导矿化结节茜素红染色；E：BMSCs成脂诱导脂滴油红O染色；F：BMSCs成骨诱导ALP染色；标尺：300μm。3.BMSCs表面标志物检测使用流式细胞仪对BMSCs表面标志物CD29、CD31、CD45、CD34、CD105和CD90进行检测，结果发现BMSCs中，CD29、CD90和CD105阳性表达，表达率分别为86.1%、93.7%和81.9%，CD31、CD45和CD34阴性表达，表达率为6.4%、1.4%和1.1%（图1-3）。图1-3流式细胞术鉴定BMSCs表面标志物3.BMSCs膜片观察和膜片细胞死活荧光染色BMSCs经膜片诱导液诱导10d左右，可见6孔板底部出现一层半透明的膜状结构，边缘卷曲（图1-4A），使用细胞刮刀沿边缘卷曲处小心刮起可完整获得细胞膜片。膜片呈乳白色半透明膜状，收缩明显，边缘卷曲形态不规则，所构建的膜片具有一定的弹性（图1-4B）。膜片诱导液诱导10d左右，可见BMSCs复层生长排列致密且成极性排列，富含细胞外基质（图1-4C）。细胞死活荧光染色结果显示膜片中红染的死亡细胞较少，主要由大量绿染的具有活力的细胞构成（图1-4D）。
18图1-4BMSCs膜片观察和膜片细胞死活荧光染色A：BMSCs膜片边缘卷曲；B：BMSCs膜片刮起后形态；C：BMSCs膜片显微镜下观；D：BMSCs膜片细胞死活荧光染色；标尺：200μm。5.BMSCs膜片的组织学观察BMSCs膜片HE染色显示膜片由3-4层细胞及细胞外基质组成，厚约30-40μm左右，细胞核呈蓝紫色，细胞外基质呈红色，细胞重叠排列界限不清（图1-5A、C）。Masson染色可见细胞通过胶原纤维紧密连接，富含胞外基质（图1-5B、D）。图1-5BMSCs膜片的组织学观察A：BMSCs膜片HE染色（标尺：60μm）；B：BMSCs膜片Masson染色（标尺：60μm）；C：BMSCs膜片HE染色（标尺：20μm）；D：BMSCs膜片Masson染色（标尺：20μm）.
【参考文献】：
期刊论文
[1]环孢素A联合牙龈卟啉单胞菌脂多糖局部应用对大鼠牙周组织缺损修复影响研究[J]. 黄美香,闫福华. 中国实用口腔科杂志. 2018(07)
[2]骨质疏松大鼠骨髓基质细胞膜片的体外构建研究[J]. 何梦娇,江俊,郑宝玉,许雄程,吴玉铭,林敏魁,陈玉玲,骆凯. 中国骨质疏松杂志. 2017(08)
[3]大黄素对骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性再灌注肾损伤的影响[J]. 李忠. 中国组织工程研究. 2016(14)
[4]骨髓间充质干细胞移植改善糖尿病肾病大鼠血糖及尿总蛋白[J]. 杜俊文,吴韬,张坤,苏白玉,卢彩萍,王伟超,雷琳,郭静霞. 中国组织工程研究. 2016(06)
[5]自体骨髓间充质干细胞移植辅助高压氧治疗高血压脑出血临床观察[J]. 张化明,杨冰. 中国实用神经疾病杂志. 2014(21)
[6]骨缺损修复生物工程研究进展[J]. 郭宜姣,李文华. 中国骨质疏松杂志. 2014(08)
[7]经皮自体骨髓间充质干细胞移植术治疗四肢骨折骨不连41例[J]. 张传开,史跃,刘英,冯晖,赵日光,刘军权. 山东医药. 2012(02)
[8]可注射性纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合骨髓间充质干细胞促进骨缺损的修复[J]. 刘阳,朱立新,杨宏,田京,许勇,于博,李志浩,冯庆玲,黄智. 中国组织工程研究与临床康复. 2010(34)
[9]人骨形成蛋白-7基因转染犬骨髓基质细胞促进牙周组织再生的实验研究[J]. 李艳芬,闫福华,钟泉,赵欣. 中华医学杂志. 2010 (20)
[10]增强型绿色荧光蛋白标记技术对骨折后骨髓间充质干细胞的迁移示踪[J]. 段小军,杨柳,周跃,辛榕,李起鸿. 中国修复重建外科杂志. 2006(02)
博士论文
[1]瘦素基因修饰组织工程化复合物对骨质疏松状态下牙周组织再生的作用研究[D]. 郑宝玉.福建医科大学 2015
[2]骨髓基质干细胞与牙周膜干细胞膜片在牙周组织再生的实验研究[D]. 唐雪鹏.第四军医大学 2012
硕士论文
[1]大鼠骨髓基质细胞体外培养及CEMP1基因转染研究[D]. 吴玉铭.福建医科大学 2018
[2]免疫磁珠分离人骨髓基质干细胞的实验研究[D]. 李静.东南大学 2006
[3]兔BMSCs体外培养及定向诱导为脂肪细胞、成骨细胞的研究[D]. 李雅娜.昆明医学院 2005
本文编号：3478277
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